NANOEMULSÕES CONTENDO BLENDS DE ÓLEOS ESSENCIAIS: CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS VISANDO A APLICAÇÃO EM COSMÉTICOS PDF Free Download
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
MARIANA MENGARDA
NANOEMULSÕES CONTENDO BLENDS DE ÓLEOS ESSENCIAIS:
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS VISANDO
A APLICAÇÃO EM COSMÉTICOS
CURITIBA
2022
2
MARIANA MENGARDA
NANOEMULSÕES CONTENDO BLENDS DE ÓLEOS ESSENCIAIS:
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS VISANDO
A APLICAÇÃO EM COSMÉTICOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor
de Ciências da Saúde, Universidade Federal do
Paraná, como requisito parcial à obtenção do
título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Seigi Murakami
Coorientadora: Prof. Dr. Thais Martins
Guimarães
CURITIBA
2022
3
4
5
Dedico este trabalho a minha família: Aos meus pais Juvêncio e Marta, aos
meus irmãos Marcelo, Milene e Murilo e as suas respectivas famílias pela
preocupação, carinho e incentivo durante esses dois anos e meio. A meu
orientador, Fábio Seigi Murakami por sempre confiar em mim. A meus colegas de
laboratório, pela ajuda e apoio. Ao meu companheiro Gustavo de Almeida Brehm
por todo o amor, incentivo e compreensão.
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela saúde e disposição durante esses tempos difíceis o
que permitiu a realização deste trabalho.
Agradeço a minha família, aos meus pais e meus irmãos que sempre me
apoiaram em todas as minhas decisões e me deram todo o suporte para chegar até
aqui.
Agradeço ao meu companheiro Gustavo de Almeida Brehm pela
compreensão dos momentos em que fiquei ausente, pelo amor e apoio, tudo seria
mais difícil se você não estivesse presente.
Agradeço ao meu orientador Fábio Seigi Murakami por passar por tantos
momentos de glória comigo, desde a minha graduação, pelo apoio, amizade,
conhecimento transmitido, incentivo, confiança, acolhimento e auxílio no
desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por estar presente em minha formação
pessoal e profissional.
Agradeço a minha coorientadora Prof. Dr. Thais Martins Guimarães por
todo apoio, carinho, ensinamentos e conversas. Ao Prof. Dr. Itamar Francisco
Andreazza pelo carinho e ensinamentos.
Agradeço a Dr. Mariana Mazetto de Carvalho, Prof. Dr. Karina Bettega
Felipe, Prof. Dr. Melissa Marques e Prof. Dr. Suelen Ávila pelo auxílio com
metodologias específicas, pelo apoio, paciência e ensinamentos.
Agradeço as minhas colegas Aline, Susana, Gabriela, Maria da Graça, e
Bruna pelo incentivo, ensinamentos e ajuda. Em especial gostaria de agradecer ao
meu colega Raul por todo apoio e incentivo durante meses de pandemia, pelos
ensinamentos, motivação e confiança depositada em mim para a execução de
diversos trabalhos.
Agradeço a Universidade Federal do Paraná, ao Departamento de
Farmácia da UFPR, ao programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da UFPR, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), e a todos os docentes pelos ensinamentos transmitidos, pela educação
gratuita e de qualidade e pelo auxílio financeiro durante o desenvolvimento deste
trabalho.
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(Madre Teresa de Calcutá)
8
RESUMO
Os óleos essenciais (OEs) apresentam diversas atividades biológicas já
comprovadas e sua utilização vem sendo muito explorada, principalmente pela
indústria de cosméticos para a substituição de compostos sintéticos contestados
pelos consumidores como os conservantes. Entretanto, a incorporação de OEs nas
formulações apresenta dificuldades, devido a insolubilidade em água, volatilização
de compostos que ocasionam a perda de suas atividades e baixa estabilidade, por
serem sensíveis a luz, oxigênio e temperatura. Estratégias como a incorporação de
OEs em sistemas nanoestruturados mostram-se promissoras para sua aplicação
em formulações, devido esses sistemas serem capazes de proteger da
volatilização, aumentar a eficácia das atividades biológicas (antimicrobiana e
antioxidante), reduzir a porcentagem de uso, melhorar a estabilidade e evitar que o
uso de OEs puros promovam reações adversas. Neste estudo, foram
desenvolvidas nanoemulsões (NEs) em dispersor Ultra-Turrax a partir da mistura
de água, Span 80 e Tween 80 nas quais foram incorporados blends formados por
6 OEs (Anis (Illicium verum Hook. f.), Canela (Cinnamomum verum J. Presl), Cravo
(Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M., Menta (Mentha spicata L.), Orégano
(Origanum vulgare L.), Tomilho (Thymus vulgaris L.)). As NEs obtidas
permaneceram estáveis por um período de 90 dias, com tamanhos de gotículas na
faixa de 100 a 286 nm, distribuição homogênea, potencial zeta > -30 mV, indicando
que não houve agregação de gotículas, com morfologia esférica, densidade em
torno de 1,00 g/mL e pH ácido. As NEs apresentaram atividade antimicrobiana
contra E. coli, P. aeruginosa, S. aureus e C. albicans e as formulações de menores
tamanhos apresentaram maior potência. No Challenge Test, realizado em uma
emulsão contendo 1% das NEs F2B1 e F2B3, avaliado nos tempos 0, 7, 14 e 28
dias, o crescimento microbiano foi controlado mesmo após duas inoculações.
Emulsões com 0,3%, 0,5%, 1%, 2% e 2,5% de F2B1 e F2B3 avaliadas quanto a
aspectos organolépticos e de pH nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias à 25 ± 2°C,
demostraram resultados positivos em todos os parâmetros. No microbiológico, após
90 dias de desenvolvimento, foi visto crescimento bacteriano de 5x103 e 1x103
UFC/mL na concentração de 0,3% para F2B1 e F2B3, respectivamente. As NEs
apresentam compostos fenólicos, que mesmo com altas taxas de volatilidade e
possíveis perdas durante o processo de obtenção, foram determinados, assim
como os flavonoides. Ambos os compostos, corroboram para os achados de
atividade antioxidante, onde NEs apresentaram valores semelhantes e em alguns
casos superiores aos blends puros. Todavia, os blends atuam em sinergia e nas
NEs suas atividades biológicas são influenciadas pela mudança no coeficiente de
partição dos OEs, alterando a sua hidrofobicidade. Devido a isso, em alguns casos,
o blend se mostrou mais evidente, como nos resultados de citotoxicidade em
fibroblastos murinos, que apresentaram menor viabilidade celular (94,48%,
96,36%, 98,23%, 91,60% e 90,47%, para B1 e 99,64%, 104,83%, 100,20%,
101,10% e 103,47%, para B3) nas concentrações de 1, 2,5, 5, 7,5 e 10 μg/mL do
que as NEs que apresentaram viabilidade celular >111,87%. As NEs mostraram-se
promissoras para aplicação como conservantes em emulsões cosméticas,
apresentam potencial atividade antioxidante e ausência de citotoxicidade nos
aspectos e margens avaliados e ainda conferem fragrância ao produto.
Palavras-chave: nanoemulsão; óleos essenciais; conservante; antimicrobiano.
9
ABSTRACT
Essential oils (EOs) have several proven biological activities and their use has been
much explored, mainly by the cosmetics industry to replace synthetic compounds
contested by consumers, such as preservatives. However, the incorporation of EOs
in formulations presents difficulties, due to insolubility in water, volatilization of
compounds that cause the loss of their activities and low stability, as they are
sensitive to light, oxygen and temperature. Strategies such as the incorporation of
EOs in nanostructured systems are promising for their application in formulations,
because these systems are able to protect from volatilization, increase the
effectiveness of biological activities (antimicrobial and antioxidant), reduce the
percentage of use, improve stability and to prevent the use of pure EOs from
promoting adverse reactions. In this study, nanoemulsions (NEs) were developed
in an Ultra-Turrax disperser from a mixture of water, Span 80 and Tween 80, in
which blends formed by 6 OEs (Anise (Illicium verum Hook. f.), Cinnamon
(Cinnamomum verum J. Presl), Clove (Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M.,
Peppermint (Mentha spicata L.), Oregano (Origanum vulgare L.), Thyme (Thymus
vulgaris L.)) were incorporated. The NEs obtained remained stable for a period of
90 days, with droplet sizes in the range of 100 to 286 nm, homogeneous distribution,
zeta potential > -30 mV, indicating that there was no aggregation of droplets, with
spherical morphology, density around 1.00 g/ml and acidic pH. The NEs showed
antimicrobial activity against E. coli, P. aeruginosa, S. aureus and C. albicans and
the smaller size formulations showed greater potency. In the Challenge Test, carried
out in an emulsion containing 1% of NEs F2B1 and F2B3, evaluated at 0, 7, 14 and
28 days, microbial growth was controlled even after two inoculations. Emulsions
with 0.3%, 0.5%, 1%, 2% and 2.5% of F2B1 and F2B3 evaluated for organoleptic
and pH aspects at 0, 30, 60 and 90 days at 25 ± 2°C, showed positive results in all
parameters. In the microbiological, after 90 days of development, bacterial growth
of 5x103 and 1x103 CFU/mL was seen at a concentration of 0.3% for F2B1 and
F2B3, respectively. The NEs present phenolic compounds, which, even with high
volatility rates and possible losses during the production process, were determined
as well as flavonoids. Both compounds corroborate the findings of antioxidant
activity, where NEs presented similar values and in some cases superior to pure
blends. However, the blends act in synergy and in the NEs their biological activities
are influenced by the change in the partition coefficient of the EOs, altering their
hydrophobicity. Due to this, in some cases, the blend was more evident, as in the
results of cytotoxicity in murine fibroblasts, which showed lower cell viability
(94.48%, 96.36%, 98.23%, 91.60% and 90.47%, for B1 and 99.64%, 104.83%,
100.20%, 101.10% and 103.47%, for B3) in concentrations of 1, 2.5, 5, 7.5 and 10
μg/mL than NEs that showed cell viability >111.87%. The NEs showed to be
promising for application as preservatives in cosmetic emulsions, they have
potential antioxidant activity and absence of cytotoxicity in the evaluated aspects
and margins, and they also provide fragrance to the product.
Keywords: nanoemulsion; essencial oils; preservative; antimicrobial.
10
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - RESULTADOS DE COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS (CFT)
DAS NANOEMULSÕES (NEs) ....................................................102
GRÁFICO 2 - RESULTADOS DE FLAVONOIDES TOTAIS (FT) DAS
NANOEMULSÕES (NEs) .............................................................105
GRÁFICO 3 - RESULTADOS DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE A PARA DPPH
DAS NEs ......................................................................................110
GRÁFICO 4- RESULTADOS DE FRAP DAS NEs .............................................110
GRÁFICO 5 - RESULTADOS DE POTENCIAL AA PARA ABTS DAS NEs ......111
GRÁFICO 6 - VIABILIDADE CELULAR FRENTE AO BLEND 1, F2B1 E F2B1a
.....................................................................................................112
GRÁFICO 7 - VIABILIDADE CELULAR FRENTE AO BLEND 3, F2B3 E F2B3a
.....................................................................................................112
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - MODELO DE ESCALA NANOMÉTRICA ..........................................21
FIGURA 2 - TÉCNICAS DE OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS UTILIZANDO O
MÉTODO DE TOP-DOWN E BOTTOM-UP .....................................22
FIGURA 3 – MODELO REPRESENTATIVO DE NANOESFERA E
NANOCÁPSULA ..............................................................................23
FIGURA 4 - ESTRUTURA GERAL DO LIPOSSOMA ...........................................26
FIGURA 5 - MECANISMO DE PENETRAÇÃO DE VESÍCULAS FLEXÍVEIS
SOBRE TECIDOS ............................................................................27
FIGURA 6 - PENETRAÇÃO DOS ETOSSOMAS PELA PELE .............................28
FIGURA 7- NANOEMULSÕES PREPARADAS PELO MÉTODO DE GUNDEL
(2020) ...............................................................................................33
FIGURA 8 - NANOEMULSÕES DESENVOLVIDAS PELO MÉTODO DE GUNDEL
E COLABORADORES (2020) ..........................................................45
FIGURA 9 - FÓRMULA DA DENSIDADE UTILIZADA PARA CÁLCULO .............47
FIGURA 10 – ESQUEMA DA DILUIÇÃO SERIADA EM MICROPLACA ..............50
FIGURA 11 - METODOLOGIA CHALLENGE TEST .............................................55
FIGURA 12 - ESQUEMA DAS MICROPLACAS DE CITOTOXICIDADE ..............60
11
FIGURA 13 - NANOEMULSÕES PELO MÉTODO DE GUNDEL et al. (2020). ....62
FIGURA 14 – NANOEMULSÕES DESENVOLVIDAS PELO MÉTODO DE
DUARTE et al. (2015) ......................................................................63
FIGURA 15 - TWEEN 20, TWEEN 80 E SPAN 80 (NOME, ESTRUTURA
MOLECULAR E EHL) ......................................................................65
FIGURA 16 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B1 APÓS 60 DIAS DE
DESENVOLVIMENTO .....................................................................80
FIGURA 17 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B1 APÓS 150 DIAS DE
DESENVOLVIMENTO .....................................................................81
FIGURA 18 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B1a APÓS 150 DIAS DE
DESENVOLVIMENTO .....................................................................81
FIGURA 19 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B3 APÓS 60 DIAS DE
DESENVOLVIMENTO .....................................................................81
FIGURA 20 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B3 APÓS 150 DIAS DE
DESENVOLVIMENTO .....................................................................82
FIGURA 21 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B3a APÓS 150 DIAS DE
DESENVOLVIMENTO .....................................................................82
FIGURA 22 - ATIVIDADE ANTIMICROBIANA EM MICROPLACAS: OE DE
CANELA, F2C E F2Ca .....................................................................84
FIGURA 23 - ENSAIO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS BLENDS 1 E 3 E
SUAS RESPECTIVAS NANOEMULSÕES PARA E. coli .................87
FIGURA 24 - ENSAIO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS BLENDS 1 E 3 E
SUAS RESPECTIVAS NANOEMULSÕES PARA P. aeruginosa ....88
FIGURA 25 - ENSAIO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS BLENDS 1 E 3 E
SUAS RESPECTIVAS NANOEMULSÕES PARA S. aureus ...........88
FIGURA 26 - ENSAIO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS BLENDS 1 E 3 E
SUAS RESPECTIVAS NANOEMULSÕES PARA C. albicans .........89
FIGURA 27 - EMULSÕES FOTOGRAFADAS AOS 90 DIAS APÓS O SEU
DESENVOLVIMENTO .....................................................................95
FIGURA 28 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA COMPOSTOS FENÓLICOS
TOTAIS ............................................................................................99
FIGURA 29 - ESTRUTURA BÁSICA DOS FLAVONOIDES ...............................103
FIGURA 30 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA FLAVONÓIDES TOTAIS ........104
FIGURA 31 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA DPPH ......................................106
12
FIGURA 32 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA FRAP ......................................106
FIGURA 33 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA ABTS ......................................107
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - BLENDS UTILIZADOS E AS CONCENTRAÇÕES DE CADA OE EM
%p/p ...................................................................................................44
TABELA 2 - CONCENTRAÇÕES DE PREPARO DAS AMOSTRAS PARA OS
ENSAIOS DE TAMANHO DE GOTÍCULA, ÍNDICE DE
POLIDISPERSÃO E POTENCIAL ZETA ...........................................46
TABELA 3 - FÓRMULA DO CREME HIDRATANTE ESCOLHIDO E QUANTIDADE
EM G COLOCADA PARA A PRODUÇÃO DE 510 G .........................51
TABELA 4 - FRACIONAMENTO DA EMULSÃO ..................................................52
TABELA 5 - FORMULAÇÃO, MÉTODO E CONCLUSÃO DOS
DESENVOLVIMENTOS DE NE .........................................................62
TABELA 6 – TAMANHO (nm) E DESVIO PADRÃO DAS NANOEMULSÕES .....67
TABELA 7 - ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO E DESVIO PADRÃO DAS
NANOEMULSÕES .............................................................................67
TABELA 8 - POTENCIAL ZETA (mV) E DESVIO PADRÃO DAS NANOEMULSÕES
...........................................................................................................72
TABELA 9 - pH E DESVIO PADRÃO DAS NANOEMULSÕES ............................75
TABELA 10 - DENSIDADE E DESVIO PADRÃO DAS NANOEMULSÕES .........78
TABELA 11 - TABELA COMPARATIVA DA CIM DOS BLENDS 1 E 3 PUROS COM
AS SUAS RESPECTIVAS NEs ..........................................................90
TABELA 12 - RESULTADOS CHALLENGE TEST PARA POOL DE BACTÉRIAS
...........................................................................................................93
TABELA 13 - RESULTADOS CHALLENGE TEST PARA POOL DE FUNGOS ..93
TABELA 14 - pH E DESVIO PADRÃO DAS EMULSÕES ....................................96
TABELA 15 - CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS NAS EMULSÕES .........98
TABELA 16 - VALORES DE CFT, FT, DPPH, FRAP E ABTS PARA OS BLENDS
1 E 3. ................................................................................................102
13
LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
°C - Grau Celsius
%p/p - Porcentagem Peso/Peso
μL - Microlitro
A/O - Emulsão água-óleo
AA - Atividade Antioxidante
ABTS - 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)
AG - Ácido Gálico
ANOVA - Análise de variância
ATCC - American Type Culture Collection
CFT – Compostos fenólicos totais
CIM - Concentração inibitória mínima
DMSO – Dimetilsulfóxido
DP – Desvio padrão
DLS – Dynamic Light Scattering
DPPH - 1,1-Difenill-2-picrilhidrazil
EAG – Equivalente de Ácido Gálico
EC – Equivalente de catequina
ET – Equivalente de trolox
F2C - Formulação: Nanoemulsão de óleo essencial de canela método com seringa
F2Ca - Formulação: Nanoemulsão de óleo essencial de canela método com agulha
F2B1 - Formulação: Nanoemulsão do blend 1 método com seringa
F2B1a - Formulação: Nanoemulsão do blend 1 método com agulha
F2B3 - Formulação: Nanoemulsão do blend 3 método com seringa
F2B3a - Formulação: Nanoemulsão do blend 3 método com agulha
FRAP - Ferric Reducing Antioxidant Power Assay
FT – Flavonoides totais
g - Grama
h - Hora
IPD - Índice de polidispersão
ME – Microemulsão
MET – Microscopia eletrônica de transmissão
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
14
mg - Miligrama
min - Minuto
mL - Mililitro
MP - Metilparabeno
MTT - (3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difenil-2H tetrazolato de bromo)
mV - Milivolt
NaCl - Cloreto de Sódio
NE - Nanoemulsão
NEs - Nanoemulsões
nm - Nanômetro
O/A - Emulsão óleo-água
OE - Óleo essencial
OEs - Óleos essenciais
pH - Potencial Hidrogeniônico
q.s. - Quantidade Suficiente
RDC - Resolução da Diretoria Colegiada
SFB – Soro fetal bovino
Trolox - 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2- ácido carboxílico
TSA - Triptic Soy Agar
TTC – Cloreto de 2, 3, 5 - trifeniltetrazólio
UFC - Unidade formadora de colônia
UV – Ultravioleta
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 17
1.1 OBJETIVOS ............................................................................................. 19
1.1.1 Objetivo geral .........................................................................................19
1.1.2 Objetivos específicos ..............................................................................19
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................. 20
2.1 NANOTECNOLOGIA ................................................................................ 20
2.1.1 Sistemas nanoestruturados ....................................................................20
2.1.1.1 Sistemas nanoestruturados poliméricos ................................................. 22
2.1.1.2 Sistemas nanoestruturados lipídicos ...................................................... 24
2.1.1.2.1 Microemulsões (MEs) .............................................................................31
2.1.1.2.2 Nanoemulsões (NEs) .............................................................................32
2.2 ÓLEOS ESSENCIAIS (OEs) .................................................................... 36
2.2.1 Nanoemulsões de OEs ...........................................................................38
2.3 COSMÉTICOS.......................................................................................... 39
2.3.1 Nanocosméticos .....................................................................................40
2.4 CONSERVANTES COSMÉTICOS ........................................................... 41
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 44
3.1 SELEÇÃO E OBTENÇÃO DOS BLENDS DE OEs .................................. 44
3.2 DESENVOLVIMENTO DAS NANOEMULSÕES ...................................... 44
3.3 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOEMULSÕES ......................................... 46
3.3.1 Tamanho de gotícula e índice de polidispersão .....................................46
3.3.2 Potencial Zeta .........................................................................................46
3.3.3 Determinação do pH ...............................................................................46
3.3.4 Determinação da densidade ...................................................................47
3.3.5 Morfologia das Nanoemulsões ...............................................................47
3.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS
NANOEMULSÕES ................................................................................. 48
3.5 DESENVOLVIMENTO DE UMA EMULSÃO PARA APLICAÇÃO DAS
NANOEMULSÕES DOS BLENDS DE ÓLEOS ESSENCIAIS ................ 51
3.5.1 Teste do desafio do poder conservante (Challenge Test) ......................53
3.5.2 Estudo de estabilidade de emulsão com nanoemulsões de blends de
OEs.........................................................................................................55
3.6 COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS, FLAVONÓIDES TOTAIS E
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ................................................................. 56
3.6.1 Compostos fenólicos totais (CFT) ..........................................................56
3.6.2 Análise de flavonoides totais (FT) ..........................................................57
16
3.6.3 DPPH......................................................................................................57
3.6.4 ABTS...... ................................................................................................58
3.6.5 FRAP..... .................................................................................................58
3.7 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE ............................................................... 59
3.7.1 Cultivo de células ...................................................................................59
3.7.2 Avaliação do potencial citotóxico das nanoemulsões por meio do método
da redução do sal de tetrazólio (MTT) ....................................................59
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................... 61
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................. 62
4.1 DESENVOLVIMENTO DAS NANOEMULSÕES ...................................... 62
4.2 TAMANHO DE GOTÍCULA E ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO .................. 65
4.3 POTENCIAL ZETA ................................................................................... 71
4.4 pH ............................................................................................................. 74
4.5 DENSIDADE ............................................................................................. 77
4.6 MORFOLOGIA ......................................................................................... 79
4.7 CONSIDERAÇÕES DOS PARÂMETROS DE CARACTERIZAÇÃO ........ 82
4.8 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ............................................................... 83
4.9 TESTE DO DESAFIO CONSERVANTE (CHALLENGE TEST) ................ 91
4.10 ESTABILIDADE DE EMULSÃO COM NES DE BLENDS DE OEs ........... 94
4.10.1 Parâmetros organolépticos e físico-químico ...........................................94
4.10.2 Parâmetro microbiológico (contagem microbiana) .................................97
4.11 COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS ....................................................... 98
4.12 FLAVONOIDES TOTAIS ........................................................................ 103
4.13 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (AA) ......................................................... 105
4.14 CITOTOXICIDADE ................................................................................. 111
5 CONCLUSÃO ...................................................................................... 114
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 116
17
1 INTRODUÇÃO
Os cosméticos são definidos como produtos que tem a finalidade de limpar,
perfumar, alterar a aparência, corrigir odores, proteger ou manter as diversas partes
externas do corpo humano. O Brasil apresenta-se como o 4º país maior consumidor
destes produtos e 2º país que mais lança produtos no mercado. As novas
pesquisas no ramo e a busca por hábitos mais sustentáveis tendem a substituição
de diversos ativos sintéticos das formulações por opções mais naturais, como é o
caso dos óleos essenciais (BRASIL, 1976; ABIHPEC, 2021).
Os óleos essenciais (OEs) são pequenas moléculas lipofílicas que
contemplam inúmeras atividades biológicas e terapêuticas, altamente voláteis por
serem uma mistura complexa de compostos orgânicos, sendo essa uma de suas
desvantagens, além de se decomporem facilmente quando estão expostos a altas
temperaturas, oxigênio, umidade e luz (BILIA et al., 2014). No entanto, estas
desvantagens podem ser minimizadas utilizando-se a nanotecnologia para
incorporação dos OEs nas formulações.
A nanotecnologia é uma ciência de manipulação de materiais em escala
nanométrica, ou seja, partículas com tamanho em torno de 1 a 1000 nm. Quando
essa tecnologia é aplicada no desenvolvimento de formulações cosméticas, são
obtidos os nanocosméticos, que são formulações cosméticas convencionais, mas
que apresentam ativos ou outros ingredientes nanoestruturados que promovem
uma melhor estabilidade da formulação, possibilitando obter produtos de liberação
controlada, de melhor absorção pela pele e proteção do ativo. Sendo consideradas
formulações mais eficazes e mais efetivas do que as formulações de cosméticos
convencionais (AHMAD et al., 2018; SANTOS et al., 2019; STRÖHER; ARMIJO;
RAFFIN, 2010).
As nanoemulsões (NEs) de OEs vêm se mostrando como uma estratégia
promissora para superar as limitações dos mesmos, incluindo a obtenção de maior
segurança na utilização da formulação, ou seja, os efeitos tóxicos presentes nos
OEs podem ser minimizados pois estes sistemas permitem utilizar uma menor
concentração de OE. Esses sistemas são dispersões coloidais de maior
estabilidade e transparência do que emulsões convencionais, que apresentam
tamanho de gotícula entre 10 à 500 nm. Devido a esses tamanhos menores de
gotículas, são consideradas como as formulações mais importantes para melhorar
18
a solubilidade de compostos como os OE, sem o uso de solventes orgânicos, sendo
assim, consideradas formulações ambientalmente corretas. (BILIA et al., 2014;
MOSSA et al., 2018; DE SIQUEIRA et al., 2020).
Atualmente, a indústria de cosméticos busca matérias-primas mais
“verdes”, sustentáveis e tecnológicas para suas formulações cosméticas. Dentro
desta nova tendência, os OEs se enquadram muito bem por apresentarem diversas
atividades biológicas que podem ser exploradas de uma forma que atenda as novas
demandas sustentáveis do consumidor. Além disso, o uso da nanotecnologia
permite o desenvolvimento de formulações de maior qualidade e segurança,
conforme demonstra este trabalho, que possibilitou o desenvolvimento de um
conservante de formulações cosméticas construído a base de blends de 6 OEs
(Anis (Illicium verum Hook. f.), Canela (Cinnamomum verum J. Presl), Cravo
(Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M., Menta (Mentha spicata L.), Orégano
(Origanum vulgare L.), Tomilho (Thymus vulgaris L.)), os quais foram incorporados
em NEs desenvolvidas com água, Tween 80 e Span 80.
19
1.1 OBJETIVOS
1.1.1 Objetivo geral
Desenvolver e caracterizar nanoemulsões (NEs) contendo blends de óleos
essenciais (OEs) avaliando as atividades antioxidante, antimicrobiana e citotóxica
bem como o potencial uso como conservante em uma emulsão cosmética.
1.1.2 Objetivos específicos
- Desenvolver NEs de blend de 6 OEs (Anis (Illicium verum Hook. f.), Canela
(Cinnamomum verum J. Presl), Cravo (Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M.,
Menta (Mentha spicata L.), Orégano (Origanum vulgare L.), Tomilho (Thymus
vulgaris L.));
- Produzir NEs de diferentes tamanhos com as mesmas matérias-primas;
- Caracterizar as NEs quanto ao tamanho, potencial zeta, morfologia, pH e
densidade;
- Quantificar o potencial antioxidante das NEs;
- Verificar a citotoxicidade das NEs;
- Determinar o potencial antimicrobiano das NEs;
- Aplicar as NEs em formulação cosmética;
- Investigar o potencial antimicrobiano das formulações cosméticas;
- Avaliar aspectos organolépticos e microbiológicos das formulações cosméticas.
20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 NANOTECNOLOGIA
Por ser uma área de pesquisa que está cada vez mais difundida em
diversos setores, inclusive no de cosméticos, a nanotecnologia, que engloba os
sistemas nanoestruturados, tem sido o foco de investimento, sendo utilizada como
uma estratégia tecnológica para o desenvolvimento de novos produtos e novas
formulações (GONÇALVES, 2014) . É conhecida como a ciência do invisível e da
inovação, que contempla física, química e biologia ao mesmo tempo (CONTERA,
DE LA SERNA, TETLEY, 2021).
O prefixo nano, de origem grega, significa “anão”. Portanto, essa tecnologia
consiste na manipulação da matéria em escala nanométrica, onde as partículas
apresentam um tamanho em torno de 1 a 1000 nm. O objetivo é criar novas
partículas com características funcionais diferentes e/ou melhores das comuns já
utilizadas (SOUTO et al., 2011; BAILLO, LIMA, 2012; SANTOS et al., 2019; VOGEL
et al., 2021).
O tamanho pode variar de acordo com a aplicabilidade do nanomaterial,
assim como a sua composição química, superfície e forma. As suas propriedades
químicas e físico-químicas também se alteram quando são submetidos à
nanoescala, sendo essas propriedades as exploradas pelos diversos setores de
aplicação, desde um simples ativo anti-idade (anti-aging) para uma indústria de
cosméticos até sistemas diferenciados de liberação de fármacos (drug deliverys)
para as indústrias farmacêuticas que com essa tecnologia conseguem direcionar e
controlar a liberação de fármacos (GAUTAM, SINGH, VIJAYARAGHAVAN, 2011;
MIHRANYAN, FERRAZ, STRØMME, 2012).
2.1.1 Sistemas nanoestruturados
Na FIGURA 1, temos alguns exemplos de partículas conhecidas de
tamanho nanométrico e onde esses sistemas se situam para dimensionar a escala
nanométrica.
21
FIGURA 1 - MODELO DE ESCALA NANOMÉTRICA
FONTE: FELLIPI (2012).
Pode-se perceber que uma nanopartícula é maior que um vírus e menor
que uma bactéria. Mas em cosméticos, por exemplo, normalmente as partículas
apresentam diâmetros compreendidos entre 100 e 600 nm (AHMAD et al., 2018).
Os sistemas nanoestruturados são muito utilizados em aplicações
farmacêuticas por propiciarem um carreamento de substâncias ativas, podendo
protegê-las, melhorar sua estabilidade, prolongar sua liberação e controlar sua
absorção, sendo uma tecnologia que visa melhorar incorporações de substâncias
ativas em formulações (MU, SPRANDO, 2010). Esses sistemas podem ser
produzidos por uma enorme quantidade de materiais como polímeros sintéticos e
naturais, lipídeos, metais, compósitos, entre outros, compatíveis com o ativo a ser
envolvido. Os métodos de preparo também são variados, é possível produzir
diferentes formatos e tamanhos de partículas como nano e micropartículas,
micelas, lipossomas, nano e microemulsões, dendrímeros, nanogéis, nanofibras,
nanotubos de carbono e fulerenos (DELOUISE, 2012; ANTUNES, 2016). Tanto os
materiais de produção quanto a técnica de preparo e a escolha do melhor sistema
nanoestruturado dependem da sua finalidade e das características do composto a
ser encapsulado. A maioria deles apresentam diferentes superfícies e
características físico-químicas (DE MATOS, LUCCA, KOESTER, 2019; DE
SIQUEIRA et al., 2020).
Basicamente, o preparo de nanopartículas se norteia pelas técnicas de
bottom-up e top-down, mostradas na FIGURA 2. A primeira considera a formação
do sistema a partir de átomos e moléculas até que se forme uma estrutura
organizada; A segunda técnica, constrói o sistema pela redução do tamanho da
22
matéria de grande dimensão, até que esta atinja o tamanho pretendido
(CHRISCHON, 2016; ABID et al., 2022).
FIGURA 2 - TÉCNICAS DE OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS UTILIZANDO O MÉTODO DE
TOP-DOWN E BOTTOM-UP
FONTE: CHRISCHON (2016).
Recentemente esses sistemas estão sendo muito explorados para entrega
de drogas (drug delivery) em locais específicos, devido a sua escala de tamanho
nano ou micro, sendo uma de suas principais vantagens a capacidade de
atravessar as membranas, para tanto, esses sistemas devem ser solúveis no meio
e entregar seu princípio ativo ao seu respectivo destino (RAJPOOT, 2019; DENG
et al., 2021). Esta forma de disponibilidade de ativos apresenta mais vantagens do
que a forma usual, pois pode aumentar a solubilidade de ativos insolúveis, reduzir
efeitos colaterais e diminuir a degradação das substâncias nos níveis extracelular
e intracelular (DE SIQUEIRA et al., 2020; TYAGI et al., 2020).
Os sistemas nanoestruturados podem ser divididos de acordo com a sua
composição, sendo os poliméricos e os lipídicos os mais utilizados para o
nanoencapsulamento de substâncias ativas e, também, além desses, considerando
aplicações cosméticas, os nanossistemas de base metálica e outros nanossistemas
adicionais (SANTOS et al., 2019; TYAGI et al., 2020).
2.1.1.1 Sistemas nanoestruturados poliméricos
Os sistemas nanoestruturados poliméricos utilizam como material
polímeros que podem ser de origem natural, sintética ou semi-sintética. O termo
“nanopartícula polimérica” refere-se às nanocápsulas ou às nanoesferas, as quais
são caracterizadas de acordo com o método de obtenção utilizado. A FIGURA 3
mostra que as nanocápsulas apresentam uma parede polimérica e um núcleo
23
geralmente oleoso, portanto são sistemas poliméricos do tipo reservatório e as
nanoesferas, são sistemas onde o ativo encapsulado pode ser conjugado com o
polímero ou estar disperso no interior, ou seja, atuam como sistemas matriciais
(AHLAWAT, HENRIQUEZ, NARAYAN, 2018; CAMPBELL, SMEETS, 2019).
FONTE: Adaptado de STEICHEN; CALDORERA-MOORE; PEPPAS (2013).
Para o desenvolvimento desses sistemas, algumas propriedades básicas
dos polímeros devem ser consideradas, como o seu mecanismo de biodegradação,
perfil toxicológico adequado, baixa imunogenicidade e compatibilidade com o ativo
que irá interagir (MIR, AHMED, REHMAN, 2017; MOLAVI, BARZEGAR-JALALI,
HAMISHEHKAR, 2020).
Os sistemas nanoestruturados poliméricos são uma alternativa
interessante para a encapsulação de ativos cosméticos por mascararem algumas
propriedades físico-químicas destes ativos, e, também por melhorarem a interação
destes com as membranas celulares, facilitando a penetração na pele (GUTERRES
et al., 2007; BECK et al., 2011).
A encapsulação dos ativos no sistema nanoestruturado polimérico ocorre
de três formas, dependendo do tipo de nanopartícula polimérica e das
características físico-química dos ativos. Estes podem estar dissolvidos ou
dispersos na matriz polimérica, encapsulados ou adsorvidos à superfície (MODI,
PILLAY, CHOONARA, 2010; STEICHEN, CALDORERA-MOORE, PEPPAS, 2013).
A liberação modificada é um grande diferencial deste tipo de sistema, pois
os ativos podem ser liberados através da dessorção, desintegração, dissolução,
difusão através de poros na matriz ou na rede polimérica e pela erosão da matriz
polimérica. Em razão de apresentarem uma alta eficiência de encapsulação, a
FIGURA 3 – MODELO REPRESENTATIVO DE NANOESFERA E NANOCÁPSULA
24
eficácia torna-se aumentada e o ativo encontra-se protegido contra as possíveis
degradações. Isso também contribui para a minimização de reações adversas, pois
o potencial irritativo dos ativos in natura encontra-se reduzido devido a camada
polimérica que o envolve, diminuindo a sua toxicidade (ABRIATA, 2018;
ZIELÍNSKA et al., 2020).
Para a obtenção das nanopartículas poliméricas vários métodos são
apresentados na literatura, a escolha, portanto, varia de acordo com o ativo, com o
polímero que será utilizado e qual a aplicação do sistema nanoestruturado.
Proteínas como albumina, gelatina e caseína são exemplos de polímeros
naturais. Incluem-se ainda compostos de origem de plantas como amido, celulose,
pectina, goma arábica; compostos como quitosana, goma xantana, alginato e
associações de quitosana com alginato (HADIYA et al., 2021). Os polissacarídeos
são carreadores promissores e protegem as características do encapsulado. São
estáveis, não tóxicos, seguros, hidrofílicos e biodegradáveis, além de serem
abundantes na natureza e, por isso apresentam baixo custo em seu processamento
(BILIA et al., 2014). Alguns exemplos de polímeros de origem sintética são os
poliésteres alifáticos como o álcool polivinílico e o ácido poliglicólico. Devido às
suas propriedades de biodegradabilidade, biocompatibilidade, ausência de
toxicidade, disponibilidade e pela sua facilidade de se agregar com uma grande
quantidade de ativos, são os mais requisitados para a construção deste tipo de
sistema (ABRIATA, 2018; MEDEIROS-NEVES et al., 2019).
Na área de cosméticos, os sistemas nanoestruturados poliméricos são
muito utilizados para o desenvolvimento de formulações com filtros solares, devido
a capacidade dos mesmos em carrear substâncias altamente lipofílicas e de facilitar
a espalhabilidade sobre a pele, assim como ocorre para as vitaminas A e E, beta-
caroteno e retinol. Além dessas características importantes, ocorre o aumento da
estabilidade desses ativos que estão protegidos de oxidações, e demais
degradações que possam vir a ocorrer devido ao encapsulamento. (CARVALHO,
2018; THI OANH et al., 2021).
2.1.1.2 Sistemas nanoestruturados lipídicos
Os sistemas nanoestruturados lipídicos contemplam as nanopartículas
lipídicas sólidas (solid lipid nanoparticle, SLN), os carreadores lipídicos
25
nanoestruturados (nanostructured lipid carriers, NLC), lipossomas, niossomas,
etossomas, microemulsões e nanoemulsões (BILIA et al., 2014; PINILLA; LOPES;
BRANDELLI, 2021). Esses sistemas apresentam algumas vantagens em relação
aos sistemas poliméricos, pois apresentam apenas lipídeos e tensoativos, sendo
mais biocompatíveis e biodegradáveis com um menor custo de produção. Além
disso, demonstram uma elevada estabilidade físico-química, permitem uma
liberação modificada devido a sua matriz, podem direcionar os ativos para o seu
local específico de atuação e não há necessidade de usar solventes orgânicos
tóxicos durante a sua produção (FONSECA-SANTOS, et al., 2020).
As SLN’s são consideradas a primeira geração de nanopartículas lipídicas,
em sua composição elas apresentam um lipídeo sólido, diferente do que acontece
com as NLC’s, consideradas como a segunda geração, essas apresentam um
lipídeo líquido em sua matriz, dessa forma apresentam um espaço maior para
acomodar substâncias em seu interior. Ambas são apropriadas para a incorporação
de ativos lipofílicos e a escolha do lipídeo é essencial para o bom desempenho
destes sistemas, sendo que os mais utilizados são triglicerídeos, ácidos graxos,
esteroides, glicerídeos parciais e ceras. Essas partículas, em sua maioria são
produzidas por homogeneização a alta pressão, método que apresenta menor
tempo de produção (GARCÊS et al., 2018; SOUTO et al., 2020). A principal
vantagem das SLN’s é que devido a sua composição, possuem ponto de fusão
superior ou igual a 40°C e, portanto, apresentam-se como partículas sólidas a
temperatura ambiente e corporal. elas são promissoras para o desenvolvimento de
nanocosméticos, caracterizam-se como multifuncionais, pois suas propriedades
oclusivas formam um filme sobre a pele ocasionando a hidratação, atuam como
filtros físicos, protegendo a pele de radiações UV, podem atuar também como filtros
químicos quando combinadas com ativo químico e como pigmentante. Entretanto,
as SLN’s apresentam algumas desvantagens quando comparadas a outros
sistemas, como baixa capacidade de carga, superior quantidade de água em sua
formulação o que pode ocasionar em crescimento microbiano e hidrolises,
transformações polimórficas dos lipídeos (separação de fases) e peroxidação de
lipídeos (RAJPOOT, 2019; SOUTO et al., 2020). As NLC’s foram desenvolvidas
com o intuito de minimizar as desvantagens das SLN’s, ou seja, elas apresentam
uma matriz imperfeita que permite acomodar uma maior quantidade de ativos e se
manter mais estável durante o seu armazenamento e demonstram uma melhor
26
liberação dos ativos ao mesmo tempo que tem menor propensão em expulsar seus
ingredientes incorporados quando armazenada (KRAMBECK et al., 2021; VIEIRA
et al., 2021).
Outro sistema nanoestruturado lipídico muito utilizado são os lipossomas,
mostrados na Figura 4. São estruturas coloidais esféricas de moléculas lipídicas
anfifílicas como fosfolipídios, a sua membrana é constituída por uma ou mais
bicamadas lipídicas que ficam ao redor do seu núcleo aquoso, seus tamanhos
variam de nanômetros a micrômetros. Devido a sua composição, apresentam
capacidade única de carregar moléculas hidrofílicas, hidrofóbicas e anfifílicas onde
as hidrofílicas situam-se no seu núcleo, as hidrofóbicas entre as caudas apolares
da bicamada e as anfifílicas entre o núcleo e a bicamada como visto na FIGURA 4
(SHEORAN et al., 2019; GUIMARÃES; CAVACO-PAULO; NOGUEIRA, 2021).
FIGURA 4 - ESTRUTURA GERAL DO LIPOSSOMA
FONTE: GUIMARÃES; CAVACO-PAULO; NOGUEIRA (2021).
O caráter anfifílico dos fosfolipídios presentes nos lipossomas mimetiza as
membranas celulares naturais dos seres eucarióticos, resultando em uma
excelente interação entre os lipossomas e estas células através da captação
celular. As formulações de lipossomas podem apresentar algumas desvantagens,
como alto custo de produção, falta de estabilidade, agregações mediante a
alterações de pH devido a redução das interações eletrostáticas, oxidação e
hidrolise dos fosfolipídios e instabilidade das bicamadas. Para solucionar estes
problemas de processo utilizam-se polímeros para revestir a superfície destas
vesículas ou ingredientes aniônicos/catiônicos na sua formulação, para
manutenção de potencial zeta em torno de +30 mV e -30 mV, garantindo assim a
sua estabilidade (KALSI et al., 2005; PANAHI et al., 2017; GOPI, BALAKRISHNAN,
27
2021). Na área cosmética, os lipossomas são utilizados para o transporte de ativos,
como reservatórios e veículos de liberação lenta, estão presentes principalmente
em formulações anti-aging por permanecerem na camada superior do estrato
córneo e promoverem a hidratação da pele, e, também por serem excelentes
encapsulantes de ativos para estes fins como coenzima Q10, vitamina A e E devido
a garantia de proteção à luz, temperatura e degradações (CHORILLI et al., 2013;
CARVALHO, 2018).
Os niossomas são vesículas flexíveis, não iônicas, formados por
tensoativos e tem como intuito modificar a barreira lipídica da pele aumentando a
permeabilidade cutânea dos ativos (MAGAR et al., 2010; WICHAYAPREECHAR et
al., 2020). São sistemas muito utilizado para preparações transdérmicas devido a
sua capacidade de permear sobre o estrato córneo como mostrado na FIGURA 5,
sendo utilizados para ativos potencialmente irritantes para pele, por eles
permearem bem, esses ativos não ficam sobre a pele e dessa forma não causam
irritação, como é o caso de ativos antiacne e psoríase, por exemplo. Essas
estruturas apresentam menor custo de produção, entretanto podem apresentar
problemas de agregação (KIM, et al., 2021; THABET; ELSABAHY; EISSA, 2022).
FIGURA 5 - MECANISMO DE PENETRAÇÃO DE VESÍCULAS FLEXÍVEIS SOBRE TECIDOS
FONTE: Adaptado de PATHAK; THASSU (2009).
Etossomas são desenvolvidos a partir de água, etanol e fosfolipídios. Assim
como os niossomas, são vesículas flexíveis que levam o seu encapsulado até as
camadas mais profundas da pele. Essa característica é concedida pela presença
do álcool em sua composição, que fluidifica os lipídeos presentes na membrana,
ocasionando abertura para que o sistema passe. A FIGURA 6 exemplifica a sua
atuação sobre a pele. Outros mecanismos também facilitam a penetração dos
etossomas, como a liberação dos seus lipídeos e/ou interação do sistema com os
lipídeos da pele e a deformação do sistema através da camada lipídica (NIU et al.,
2019; PAIVA-SANTOS et al., 2021). Podem ser incorporados a formulações
28
cosméticas, sendo mais eficientes do que lipossomas, por levarem os ativos até as
camadas mais profundas da pele, apresentam estabilidade e solubilidade
melhorada, porém sua capacidade de encapsulamento é menor, o que ocasiona
um alto custo e o álcool presente pode ocasionar algum tipo de reação cutânea em
algumas pessoas. Na indústria cosmética esses sistemas são muito utilizados em
cosméticos anticelulite e na indústria farmacêutica é utilizado para transportar
ativos antiacne e de condições como psoríase e câncer de pele (NAINWAL et al.,
2019; PAIVA-SANTOS et al., 2021).
FIGURA 6 - PENETRAÇÃO DOS ETOSSOMAS PELA PELE
FONTE: Adaptado de PATHAK; THASSU (2009).
NOTA: 1) Fluidificação dos lipídeos na pele pela liberação do etanol aumentando
a sua penetração; 2) Interação do conteúdo dos etossomas com os lipídeos da
pele; 3) Deformação dos etossomas e sua penetração na pele.
Os fitossomas (Phytossomas) também se apresentam como vesículas
semelhantes aos lipossomas, formados por fosfolipídios com compostos ou
extratos vegetais. Os flavonoides são os compostos mais utilizados para a
fabricação desde tipo de sistema (ALHARBI et al., 2021). A diferença entre os
fitossomas e os outros sistemas lipídicos que são carregados com compostos
vegetais é que nos fitossomas os compostos ou extratos vegetais são
homogeneizados juntos com os fosfolipídios, formando o complexo compostos-
fosfolipídios, este complexo é homogeneizado com colesterol em solventes
adequados para a formação da vesícula. Já na formação de lipossomas, os
fosfolipídios são homogeneizados primeiro com os outros lipídeos para a formação
da vesícula lipossomal e o composto fitoquímico é incorporado ao final (BOZZUTO;
MOLINARI, 2015; KARIMI et al., 2015; HOQUE et al., 2021).
NEs e microemulsões (MEs) são nanodispersões coloidais que apresentam
muitas semelhanças, mas também muitas diferenças significativas que permitem a
sua distinção e identificação (NASTITI et al., 2017). O prefixo diz respeito ao
tamanho das partículas da fase dispersa, embora exista essa diferença de
29
tamanho, as gotículas de óleo de nano e MEs podem estar sobrepostas
apresentando valores na faixa nanométrica, mas ressalta-se que o intervalo
nanométrico é muito variável de autor para autor (GARAVAND et al., 2021).
A estrutura dessas gotículas é quase a mesma, sendo um núcleo oleoso
rodeado por uma monocamada ou multicamadas de surfactante com as caudas
apolares em direção ao núcleo oleoso e as cabeças polares em direção ao meio
aquoso (ARAUJO et al., 2020). Essas nanodispersões se diferenciam também pelo
seu formato de gotícula de óleo, as das NEs são mais esféricas e as das MEs são
esféricas ou não, cilíndricas, planas ou semelhantes a esponja devido a tensão
superficial mais baixa. O formato das gotículas depende do empacotamento e da
curvatura das moléculas de surfactante na interface óleo-água e a quantidade de
óleo presente na formulação (LALANI et al., 2015; PAVONI et al., 2020).
O que as diferencia é a energia livre do sistema, considerada um fator
crucial que influencia seu processo de preparação e estabilidade a longo prazo.
Para ambas, na sua maioria, os ingredientes utilizados são água, óleo, surfactantes
e co-surfactantes em alguns casos (ANTON, VANDAMME, 2011). Entretanto, NEs
podem ser formuladas com diversos surfactantes, enquanto MEs requerem apenas
moléculas capazes de conferir uma tensão interfacial baixa, por isso a sua
composição na maioria das vezes é determinada por testes através da construção
de um diagrama de fase pseudoternário. As propriedades da formulação dependem
da escolha do surfactante e do co-surfactante baseado na fase oleosa (PAVONI et
al., 2020).
Os surfactantes são moléculas anfifílicas, ou seja, apresentam uma longa
cauda formada por uma cadeia de carbonos (parte apolar da molécula) e uma
cabeça com um grupamento polar, podendo ser catiônica, aniônica ou ambas
(zwitteriônicos), ou não-iônica. É o grupamento presente na cabeça da molécula
que classifica o surfactante. Eles tem como objetivo reduzir a tensão superficial
presente entre uma fase aquosa e uma fase oleosa (GHOSH; RAY; PRAMANIK,
2020).
Um dos fatores mais importantes no desenvolvimento de micro e NEs é a
escolha dos surfactantes, pois as propriedades podem ser influenciadas pelo
equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL ou HLB do inglês hydrophile-lipophile balance) em
função da fase oleosa da formulação, quando o valor de EHL do surfactante é bem
30
próximo do exigido pelo óleo, atingem-se menores tamanhos de gotículas com
estreita distribuição (FOO et al., 2020).
Os surfactantes não iônicos são estabilizados por interações dipolo e
interações de hidrogênio, sendo os de primeira escolha para o desenvolvimento
desses sistemas por apresentarem um perfil toxicológico mais seguro, garantir
baixa tensão superficial e cinética de adsorção rápida (SMAIL et al., 2021). Os mais
utilizados são os ésteres de sacarose, ésteres de sorbitan (Spans), polissorbatos
(Tweens, esses conferem uma formulação estável sem a necessidade de um co-
surfactante), polioxietileno e laurato de sacarose (FOO et al., 2020).
O tween 80 e o Span 80 são surfactantes não iônicos constantemente
utilizados, combinados em diferentes proporções para conferir o grau de
emulsificação desejado, são compatíveis e estáveis com diversos tipos de
sistemas. Os spans são derivados da desidratação do sorbitol através da reação
de esterificação com ácidos graxos e apresentam valores de EHL mais baixos,
sendo 4,3 o do span 80. Esse valor favorece a sua solubilidade em solventes
lipofílicos. Os tweens são produzidos a partir da etoxilação dos spans, apresentam-
se como mais hidrofílicos do que os spans, como é o caso do tween 80, por
apresentar EHL de 15, quanto maior o valor de EHL, mais hidrofílico é o surfactante
(JUÁREZ-OSORNIO, GRACIA-FADRIQUE, 2017; KOPANICHUK et al., 2018; FOO
et al., 2020).
Os co-surfactantes são constituídos por moléculas anfifílicas que devido ao
seu pequeno tamanho não conseguem estabilizar sozinha uma emulsão, portanto
atuam sinergicamente com os surfactantes, eles permitem uma maior penetração
da fase oleosa entre as caudas dos surfactantes (SMAIL et al., 2021). São mais
utilizados em MEs para acelerar o processo de preparação. Para NEs são utilizados
quando o desenvolvimento se dá através de métodos de baixa energia (PAVONI et
al., 2020; SUNAINA et al., 2019).
Os co-surfactantes mais comuns são os álcoois de cadeia curta/média por
serem pequenas moléculas de natureza anfifílica com uma cadeia de
hidrocarboneto e um grupamento hidroxila, eles se difundem prontamente entre as
fases atingindo a interfase e se intercalam entre as moléculas de surfactantes
enfraquecendo as interações entre a cabeça e a cauda de hidrocarbonetos,
causando um filme interfacial mais flexível sobre as gotículas (YE et al., 2021).
Associações de surfactantes de diferentes valores de EHL (sistemas mistos),
31
também são nomeados como co-surfactantes, e facilitam a formação e
estabilização dos sistemas formados por melhorarem o desenvolvimento de
pequenas gotículas (CHOI, CHOI, LEE, 2021).
2.1.1.2.1 Microemulsões (MEs)
As MEs são consideradas monodispersões transparentes de gotículas em
um sistema de dois líquidos imiscíveis estabilizados por uma membrana interfacial
de surfactantes. Essa mistura não é uma emulsão e sim uma solução verdadeira
pelo fato do óleo estar dissolvido na micela e não estabilizado por uma
monocamada de surfactantes como é o caso da NE (DE ASSIS et al., 2020;
GARAVAND et al., 2021).
Esse sistema é termodinamicamente estável, com tamanho de gotículas
variando entre 5 a 100 nm, isotrópico, liofílico e de baixa viscosidade, podendo ser
do tipo óleo/água (O/A), água-óleo (A/O) ou bicontínua (SZUMAŁA; WYSOCKA,
2018). Sua transparência se dá devido ao tamanho médio de gotículas formadas
durante seu processo de desenvolvimento. Esses sistemas servem como veículos
para transporte de substâncias como ativos, fármacos e demais substâncias
químicas ou naturais com características diferentes (lipofílicos ou hidrofílicos),
podendo melhorar a sua eficácia, proteger do ambiente externo, modificar a sua
liberação ou prolongar a sua ação, aumentar a especificidade da substância no seu
local de ação diminuindo seus efeitos colaterais (GANDHI et al., 2020; MENDONÇA
et al., 2020).
Podem ser preparadas espontaneamente (método de baixa energia) pela
mistura de água, óleo e surfactantes, porém uma energia externa como baixo
aquecimento ou agitação magnética pode ser empregada para superar barreiras
cinéticas que poderiam retardar a sua formação, ou podem ser preparadas pelo
método de inversão de fase a temperatura específica que supere a barreira cinética.
É preparado a fase A/O, essa é aquecida até uma temperatura em que a interação
da água com o surfactante se torna mais fraca, a solubilidade do surfactante em
óleo aumenta e ocorre uma inversão de fase para O/A. Durante o resfriamento, sob
agitação, ocorre a diminuição do tamanho das gotículas e da tensão interfacial
dando origem a ME O/A. Esse método requer atenção se a fase oleosa permite o
32
aquecimento sem que ocorra a sua degradação (LALANI et al., 2015; LIANG et al.,
2020; ALMASI et al., 2021).
Esse sistema apresenta como vantagem sua característica física líquida
com capacidade de alta permeação devido ao tamanho de suas gotículas,
entretanto, uma das desvantagens desse sistema é a alta quantidade de
surfactantes necessária, que quando utilizado em aplicações farmacêuticas pode
causar toxicidade, diferente das NEs que requerem uma quantidade menor de
surfactantes, devido ao seu método de produção de baixa energia. É um método
eficaz para a formação de gotículas menores, rápido e não necessita de
equipamentos, porém é necessária uma grande quantidade de surfactantes
(PAVONI et al., 2020).
2.1.1.2.2 Nanoemulsões (NEs)
São emulsões com gotículas esféricas, polidispersas de 10 a 500 nm,
sendo que esse tamanho pode variar entre 20 e 500 nm ou 50 a 1000 nm,
dependendo do pesquisador. Entretanto muitos consideram 500 nm como limite
máximo de tamanho para o sistema ser considerado uma NE (ROCHA-FILHO, et
al., 2014; YUKUYAMA et al., 2016). Elas apresentam alta estabilidade cinética,
porém não são termodinamicamente estáveis. Neste sistema a gota de óleo é
estabilizada por uma monocamada de surfactantes. Apresentam-se leitosas,
opacas ou quase transparente, como mostrado na FIGURA 7 e podem ser do tipo
O/A e A/O. É um dos sistemas nanoestruturados cada vez mais utilizado pelas
indústrias alimentícias, farmacêuticas e cosméticas para encapsulação, proteção e
liberação controlada de ativos/ingredientes (SZUMAŁA, WYSOCKA, 2018; FENG
et al., 2020). Alguns exemplos da utilização desse sistema para a encapsulação de
ativos/ingredientes são: Vitamina E e D (ADI et al., 2019; MEHMOOD; AHMED,
2020), óleos essenciais (TALEB et al., 2018; GUO et al., 2020), fármacos
(PANGENI et al., 2016; CONG et al., 2017; BHALERAO; KOTESHWARA;
CHANDRAN, 2020), meio de crescimento de microalgas (NIGAM; MALIK; SINGH,
2021), pigmentos (ROSTAMABADI; FALSAFI; JAFARI, 2019) e suplementos (whey
protein e luteína) (LI et al., 2018; SZUMAŁA; PACYNA-KUCHTA; WASIK, 2021).
33
FIGURA 7- NANOEMULSÕES PREPARADAS PELO MÉTODO DE GUNDEL (2020)
FONTE: A autora (2022).
São polidispersões geralmente compostas por uma fase aquosa e outra
oleosa, miscíveis pela ação de moléculas anfifílicas como surfactantes presentes
no meio que diminuem a tensão superficial entre essas duas fases imiscíveis
(ALMASI et al., 2021). São formulações não gordurosas de textura fluida, facilmente
absorvidas pela pele e sensorialmente agradáveis (ARIANTO; CINDY, 2019). As
suas fases separadas possuem uma menor energia livre em relação ao sistema
coloidal, por isso a sua formação é desfavorável, ou seja, não são formadas
espontaneamente, só na presença de uma energia externa que ultrapasse a
energia entre as fases separadas e o sistema coloidal. Sua formação se dá por
métodos de alta e baixa energia, por este motivo são capazes de carregar maior
quantidade de fase dispersa na presença de menor quantidade de surfactantes,
sendo preferidas quando diz respeito ao quesito de baixa quantidade de
surfactante, por exporem um perfil de toxicidade e segurança melhor do que as
MEs (LIMA et al., 2021; WANG et al., 2020).
São mais atrativas no ponto de vista industrial pois seu desenvolvimento é
comparativamente mais simples do que o de outros sistemas nanoestruturados,
suas tecnologias de produção não necessitam tanta sofisticação (SHARIFI et al.,
2021).
Os métodos de alta energia requerem dispositivos mecânicos como rotores
de alta taxa de cisalhamento, homogeneizadores de alta pressão,
microfluidizadores, homogeneizadores ultrassônicos para realizarem a
emulsificação e a obtenção de gotículas nanométricas com melhor controle de
tamanho (YUKUYAMA et al., 2016; MOHD ZAFFARIN et al., 2020).
Já os métodos de baixa energia, podem ser produzidos pela alteração de
energia química dos componentes, como pelo método de inversão de fase,
34
temperatura de inversão de fase / emulsificação espontânea. São métodos que
chamam a atenção devido ao interesse em utilizar menos energia na técnica de
processo visando a economia (KOMAIKO; MCCLEMENTS, 2014). O método de
inversão de fase consiste na adição lenta de água em uma mistura da fase oleosa
com surfactantes, que reduz a tensão interfacial entre a água e o óleo, diminuindo
a energia necessária para gerar gotículas de NE, entretanto esse método gera
gotículas grandes e polidispersas (ROLLAND et al., 2021), a partir de uma
emulsificação espontânea, ocasionada pela adição de água na fase oleosa junto
de surfactantes (WANG et al., 2020).
No método de temperatura de inversão de fase, a NE se forma quando a
mistura água-óleo-surfactante é rapidamente resfriada abaixo da sua temperatura
de inversão de fase. Segundo Roger et al. (2011), este método é mais eficiente do
que o método de inversão de fase para a obtenção de gotículas menores e de
distribuição uniforme, entretanto este método não é viável para a produção de lotes
em escala industrial, pela dificuldade de obter uma rápida elevação ou diminuição
da temperatura. Se este processo não for rápido o suficiente, são formadas NEs
polidispersas com alta chance de coalescência.
Além disso, alguns estudos mostram que o pH pode ser utilizado para
controlar a inversão da emulsão junto com tensoativos sensíveis a variações de pH.
Dessa forma, a inversão de fase pode ser induzida pelo pH para a formação das
NEs, apresentando uma emulsificação e desemulsificação controlada (CHEN,
DENG, AN, 2014; SHI, et al., 2018).
A diluição de MEs com água, também pode dar origem a NEs (O/A), sendo
considerado também um método de baixa energia, porém a fração de massa da
fase dispersa é baixa, não sendo um método de desenvolvimento (KOROLEVA;
YURTOV, 2012).
O desenvolvimento de um diagrama de fases pseudoternário, para a
elaboração das formulações é uma opção interessante para determinar a proporção
ideal de óleo, surfactante, co-surfactante e água em que as NEs são formadas, o
mesmo vale para as MEs (WIK et al., 2020).
As NEs do tipo O/A são as mais utilizadas em cosméticos, pois as suas
gotículas permitem a estabilização e o transporte de compostos hidrofóbicos,
muitos deles utilizados na indústria cosmética como agentes anti-envelhecimento,
compostos antioxidantes, vitaminas e OEs. Elas também se tornam mais atraentes
35
como carreadoras de ativos cosméticos por apresentarem vantagens como: a) o
tamanho nanométrico permite elevada superfície de contato de suas gotículas; b)
por serem transparentes / quase transparentes ou leitosas e apresentarem baixa
viscosidade são esteticamente atrativas; c) transportam lipídeos para a pele
atuando como emolientes, ocasionando na diminuição de perda de água pela pele
estimulando a função barreira (PEREIRA et al, 2016; ASHAOLU, 2021).
Apresentam resultados promissores para o desenvolvimento de produtos
com afinidade pela pele, evitando a absorção pela corrente sanguínea. São vistos
efeitos de aumento de hidratação e da concentração de colágeno na pele em
produtos anti-envelhecimento, melhora da ação anti-inflamatória quando
comparada a emulsão convencional preparadas com o mesmo extrato vegetal
(BRESOLIN, et al., 2016).
Ainda em cosméticos, elas podem substituir lipossomas e vesículas, que
são menos estáveis e apresentam alto custo de produção. O seu tamanho previne
a ocorrência de floculação e coalescência, mantendo o sistema disperso e estável,
além de serem eficientes em facilitar a penetração de ativos pela pele devido a sua
grande área superficial, resultante da grande quantidade de gotículas nanométricas
permitirem uma distribuição uniforme na pele, garantindo uniformidade na
penetração de ativos (TADROS et al, 2004; YUKUYAMA et al., 2016).
As NEs também apresentam algumas desvantagens, pois podem sofrer
fenômenos de instabilidade como coalescência, maturação de Ostwald, floculação,
cremeação e inversão de fases, devido aos movimentos Brownianos de suas
gotículas e isso afeta diretamente na liberação controlada de seus ativos.
Entretanto, esses fenômenos são de fácil detecção visual na formulação (RAI et al.,
2018; DANTAS et al., 2021).
O amadurecimento de Ostwald é um processo pelo qual gotículas maiores
presentes nas NEs crescem, por processos de condensação e agregação, a partir
de gotículas menores, devido a difusão molecular do óleo entre as gotículas na fase
continua (WOOSTER; GOLDING; SANGUANSRI, 2008; YUKUYAMA et al., 2016).
A adição de substâncias altamente polares e de grande volume molar como
triglicerídeos de cadeia média ou longa ou óleos vegetais como óleo de milho e
óleo de girassol podem evitar esse problema, atuando como uma barreira cinética,
tornando os OEs menos solúveis em água, pois quanto mais lipofílico for o óleo
menor é a chance desta instabilidade. Entretanto deve-se atentar para a utilização
36
dessas substâncias, pois nos estudos de Ziani e colaboradores (2011) e de Wan e
colaboradores (2019), os triglicerídeos de cadeia média e o óleo de milho alteraram
o coeficiente de partição Óleo/Água dos OEs e isso prejudicou as atividades
biológicas dos mesmos, como é ocaso da NE de OE de tomilho que apresentou
atividade antimicrobiana reduzida e a diminuição da atividade antifúngica do OE de
cravo da índia.
Os fatores de instabilidade estão diretamente ligados ao tamanho, índice
de polidispersão (IPD) e potencial zeta das gotículas. Esses parâmetros são
cruciais e devem ser avaliados logo após o desenvolvimento destes sistemas.
Quanto menores, menos polidispersas (IPD < 0,4) e potencial zeta maior do que
±30mV, mais estável é o sistema (SHARIFI et al., 2021; LIANG et al., 2022).
Deve-se ressaltar também que a estabilidade das NEs depende dos
ingredientes de formulação e metodologia utilizada, fatores que determinam os
resultados de caracterização das mesmas (ASHAOLU, 2021).
2.2 ÓLEOS ESSENCIAIS (OEs)
Os óleos essenciais (OEs) são conhecidos como pequenas moléculas
lipofílicas, líquidas, podendo ser límpidos ou apresentarem alguma coloração, são
altamente voláteis por serem uma mistura complexa de compostos orgânicos que
incluem hidrocarbonetos como terpenos (formados por unidades de isopreno),
sesquiterpenos e compostos oxigenados. Podem se decompor facilmente quando
são expostos a altas temperaturas, oxigênio, umidade e luz, logo para realizar um
uso adequado do OE em questão é importante conhecer a sua composição
(FELIPE, BICAS, 2017; CARBONE et al., 2018). As reações de decomposição são
desencadeadas enzimaticamente ou quimicamente, portanto todo o procedimento
desde a sua obtenção até o seu armazenamento e uso deve ser monitorado para
manter a sua qualidade. Devido as suas características organolépticas e de
viscosidade, é possível identificar quando está degradado (BILIA et al., 2014;
PAVONI et al., 2020).
São caracterizados como metabólitos secundários das plantas,
sintetizados por todos os órgãos (caule, raiz, folhas, pétalas de flores, sementes,
frutos) (MARCHESE et al., 2020). Podem ficar armazenados em células secretoras,
37
canais, tricomas, cavidades e células epidérmicas (BILIA et al., 2014; VELLA et al.,
2020).
O termo “OE” é designado para as substâncias obtidas a partir do material
vegetal cru por destilação com água / vapor ou por processo mecânico e destilação
a seco no caso de epicarpo de frutas. São separados facilmente de outros
compostos da planta devido ao seu baixo peso molecular, por diversos métodos de
extração (DE MATOS et al., 2019).
O perfil químico dos OEs varia devido a diversidade de moléculas
presentes e ao método de extração, que pode influenciar na quantidade dos
componentes. Em geral são caracterizados por 2 ou 3 componentes majoritários
que estão em altas concentrações (20-70%), sendo os que determinam suas
propriedades terapêuticas e biológicas, em comparação com os outros
componentes que estão em menores quantidades (CHOUHAN; SHARMA;
GULERIA, 2017). Seu perfil também varia devido a composição do solo onde a
planta está presente, clima, parte da planta, idade e estágio de ciclo vegetativo que
se encontra. Em monografias presentes tanto na farmacopeia como em outros
documentos é possível caracterizar e analisar a qualidade do OEs obtido a partir
do gênero e espécie da planta (BILIA et al., 2014).
Os OEs apresentam interesse em sua aplicação devido as suas
propriedades terapêuticas como: analgésica, anti-inflamatória, sedativa,
espasmolítica e por suas propriedades biológicas: bactericida, fungicida, viricida,
antiparasitário, inseticida. Essas propriedades variam entre os OEs devido a sua
composição (ALVES, LAVÔR, RAMOS, 2021; VELLA et al., 2020).
Muitos estudos mostram a eficácia de OEs como antimicrobianos sobre
diversas cepas, essa atividade biológica proeminente dos OEs se dá através da
sua hidrofobicidade, que permite uma melhor interação com os lipídeos presentes
na membrana celular de micro-organismos, tornando-os mais permeáveis pelas
células (DA SILVA et al., 2021). São poderosos em reduzir a resistência bacteriana
quando combinados com outros antimicrobianos (YAP et al., 2013), modulando a
resistência às drogas por mecanismos de efluxo em várias espécies de bactérias
Gram-negativas, por exemplo (CHOUHAN; SHARMA; GULERIA, 2017).
Atualmente, percebe-se o aumento da utilização de OEs em produtos de
uso humano e veterinário, devido a busca por substâncias mais naturais (DE
GODOI et al., 2017). Esses produtos são na maioria de uso externo, sendo a
38
aplicação tópica a de maior utilização. Esta aplicação é considerada uma das mais
seguras, entretanto por serem moléculas pequenas e lipofílicas, atravessam
facilmente as membranas, sendo necessário uma aplicação cautelosa,
principalmente quando o OE é concentrado e ao aplicar sobre a pele lesionada
pode ocorrer o aumento da absorção sistêmica, levando a possíveis efeitos
colaterais (SHARMEEN et al., 2021). Alguns OEs cítricos, como o caso da
bergamota, sensível aos raios ultravioletas, podem ocasionar irritação de pele ou
até mesmo queimaduras após a exposição solar (MARCHESE et al., 2020). Ainda,
OEs que apresentam seus componentes terpenóides oxidados, quando utilizados
por via tópica podem levar a uma hipersensibilidade da pele, semelhante a uma
dermatite de contato alérgica. Evidências mostram que a distribuição dos OEs ao
longo do corpo é alta devido a sua característica lipofílica, porém sua metabolização
é rápida (BILIA et al., 2014).
2.2.1 Nanoemulsões de OEs
NEs podem ser utilizadas como estratégias para melhoria da incorporação
de OEs em outros sistemas. São atraentes pela sua facilidade de manipulação,
manuseio e custo de fabricação (MOGHIMI et al., 2016) e a principal vantagem de
incorporar OEs está ligada diretamente com a melhora da sua estabilidade e
eficácia (LIMA et al., 2021).
Devido os OEs serem substâncias sensíveis a oxigênio, luz, umidade,
aquecimento e serem voláteis, a sua aplicabilidade nas indústrias farmacêuticas,
em cosméticos e em alimentos fica diminuída (NIRMAL et al., 2018). A incorporação
de OEs em sistemas nanoestruturados é um método mais eficaz para desenvolver
formulações contendo OEs, pois estes sistemas garantem estabilidade física,
menor volatilização e proteção contra interações ambientais (luz, umidade, pH,
oxigênio), além de aprimorarem a bioatividade e reduzirem a toxicidade. Esses
sistemas são escolhidos de acordo com a aplicabilidade final da formulação e
podem variar quanto a forma, natureza e tamanho (CHOUHAN; SHARMA;
GULERIA, 2017).
Ao longo dos últimos anos, devido a sua eficiente atividade antimicrobiana,
tanto a indústria de cosméticos quanto a de alimentos demonstraram um aumento
39
no interesse em usar OEs como conservantes garantindo ao consumidor produtos
mais naturais e com maior segurança (SHARMEEN et al., 2021). Vários estudos
mostram que para tal finalidade as NEs são excelentes candidatas para a
incorporação de OEs para aplicação em alimentos e cosméticos, por serem mais
seguras do que MEs, por exemplo, pela sua baixa carga de surfactantes presente
(GHAYEMPOUR; MONTAZER, 2016). Elas também facilitam a dispersão do OE
nos alimentos e potencializam a atividade antimicrobiana e demais atividades
biológicas.
As propriedades das NEs, assim como a sua formação e estabilidade são
afetadas e influenciadas pelas propriedades físico-química dos OEs (BILIA et al.,
2014).
Em formulações de NEs gotículas menores são formadas na presença de
OEs de baixa tensão superficial e viscosidade, pois óleos de baixa viscosidade
requerem menor tempo e menos energia para reduzirem de tamanho e óleos
altamente hidrofóbicos impossibilitam a formação de NEs através do método de
inversão de fases. Portanto, OEs de baixa viscosidade, baixa tensão superficial e
alta polaridade são os ideais para a formação de NEs (PAVONI et al., 2020).
O principal problema de instabilidade de NEs com OEs é a coalescência e
o amadurecimento de Ostwald (RAI et al., 2018; DANTAS et al., 2021).
2.3 COSMÉTICOS
Segundo o Art. 3º, Inciso IV da Lei Fed. nº 6.360/76, os produtos
cosméticos, de higiene pessoal e perfumes são definidos como: “Preparações
constituídas por substâncias naturais ou sintéticas, de uso externo nas diversas
partes do corpo humano, pele, sistema capilar, unhas, lábios, órgãos genitais
externos, dentes e membranas mucosas da cavidade oral, com o objetivo exclusivo
ou principal de limpá-los, perfumá-los, alterar sua aparência e / ou corrigir odores
corporais e/ou protegê-los ou mantê-los em bom estado”.
Esses produtos são sujeitos ao controle da vigilância sanitária e são
classificados conforme o grau de risco à saúde, podendo ser de Grau I, produtos
de notificação ou de Grau II, produtos com registro.
40
Essa lei ainda considera que cosméticos são: “Produtos para uso externo,
destinados à proteção ou ao embelezamento das diferentes partes do corpo, tais
como pós faciais, talcos, cremes de beleza, creme para as mãos e similares,
máscaras faciais, loções de beleza, soluções leitosas, cremosas e adstringentes,
loções para as mãos, bases de maquilagem e óleos cosméticos, ruges blushes,
batons, lápis labiais, preparados antissolares, bronzeadores e simulatórios, rímeis,
sombras, delineadores, tinturas capilares, agentes clareadores de cabelos,
preparados para ondular e para alisar cabelos, fixadores de cabelos, laquês,
brilhantinas e similares, loções capilares, depilatórios e epilatórios, preparados para
unhas e outros”.
Segundo dados da Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal,
Perfumaria e Cosméticos (ABIHPEC), em 2021 o Brasil foi considerado o 4° maior
mercado consumidor desses produtos do mundo, movimentando cerca de US$
22,9 bilhões, o 2° maior mercado em fragrâncias, produtos masculinos e
desodorantes, o 2° mercado no ranking global de países que mais lançam produtos
anualmente que gerou cerca de 5,4 milhões de empregos.
A tendência atual para os cosméticos, que segue em crescimento, são
produtos com compostos naturais em sua formulação e a ausência de substâncias
químicas e sintéticas que possam gerar danos à saúde do consumidor. As
alegações “free from” (livre de) também mostram-se como uma característica
desejada pelos consumidores (ABELAN et al., 2022).
2.3.1 Nanocosméticos
São definidos como formulações cosméticas usuais mas que apresentam
seu princípio ativo ou outro ingrediente da formulação na escala nanométrica
(AHMAD et al., 2018). São tendências entre os cientistas pois a melhor solubilidade
e estabilidade dos ingredientes ativos em tamanhos nanométricos permite uma
penetração nas camadas mais profundas da pele e consequentemente uma maior
eficácia dos produtos, alcançando as expectativas dos consumidores (NOHYNEK;
DUFOUR; ROBERTS, 2008; AHMAD et al., 2018).
Além da melhora da eficácia dos ativos, as formulações se tornam mais
estáveis, pois esses sistemas são capazes de minimizar as incompatibilidades e os
inconvenientes de formulação, como baixa solubilidade de ativo, minimizar
41
características organolépticas indesejáveis (odor, textura, cor), melhorar a
aparência do produto final e garantir segurança (MU, SPRANDO, 2010;
NASCIMENTO, PINHEIRO, 2014).
Os nanocosméticos também garantem multifuncionalidade, pois o mesmo
ativo, que está na escala nanométrica, pode estar encapsulado com outro ativo
hidratante, ou por si só já conferir oclusão a pele, promovendo a hidratação, ou até
mesmo conferir cor, atendendo aos requisitos atuais dos consumidores, que
procuram cosméticos com várias funcionalidades em um único produto
(NASCIMENTO, PINHEIRO , 2014; MIASTKOWSKA et al., 2018).
Os sistemas nanoestruturados lipídicos são os mais utilizados para
aplicação tópica, estes englobam as NEs que apresentam alto potencial de entrega
controlada, segurança, biocompatibilidade e garantem boa penetração dos ativos
na pele (SANTOS et al., 2019).
Alguns pesquisadores ainda questionam a utilização de nanomaterias em
produtos cosméticos, devido a absorção dessas partículas ou não. Entretanto,
Fardous e colaboradores (2021) mostraram que gotículas com tamanho < 250 nm
não podem penetrar sob peles saudáveis devido as apertadas junções entre as
células endoteliais. O regulamento (CE) n.º 1223/2009 do parlamento europeu e do
conselho, utilizado pelas indústrias que fazem uso de nanomateriais, determina que
em produtos cosméticos, nanomateriais são produtos insolúveis ou biopersistente
e fabricado intencionalmente com uma ou mais dimensões externas ou uma
estrutura interna, na escala de 1 a 100 nm. Todavia as partículas utilizadas pela
indústria tendem a ser > 100 nm, para que não se enquadrem como utilizando
nanomateriais, visto que esse assunto ainda está em discussão (MU, SPRANDO,
2010; DELOUISE, 2012; SANTOS et al., 2019).
2.4 CONSERVANTES COSMÉTICOS
Os produtos cosméticos são não-estéreis, por isso toleram pequenas
quantidades de fungos e bactérias, entretanto quando em altas concentrações o
produto é classificado como contaminado. A contaminação microbiana ocorre em
condições normais de fabricação (pessoas, equipamentos, ambiente, matérias-
primas e embalagem), no transporte quando exposto a altas temperaturas, durante
42
a sua venda ou pelo uso do consumidor (KERDUDO et al., 2016; HALLA et al.,
2018).
Por este motivo os conservantes são matérias-primas de formulações com
o objetivo de oferecer resistência a contaminações microbiológicas para o produto
durante sua fabricação, estocagem e período de uso (BRASIL, 2012; KERDUDO
et al., 2016).
No período de 1975 – 1985 o FDA desenvolveu o teste de eficácia do
conservante (Challenge Test), devido a inúmeras contaminações por micro-
organismos que vinham aparecendo historicamente relacionados a cosméticos e
produtos de higiene pessoal. O Challenge Test é utilizado tanto para avaliar a
eficácia do conservante na formulação quanto o potencial de irritação e toxicidade
para o consumidor, pois o produto deve apresentar a menor concentração de
conservante possível desde que seja estável e ofereça eficácia e segurança. Este
ensaio é realizado durante o desenvolvimento do produto, modificações de
formulação e avaliação final do sistema conservante escolhido (GUIA ABC
MICROBIOLOGIA, 2014; BRASIL, 2019).
A resolução de diretoria colegiada – RDC n° 528 de 4 de Agosto de 2021,
dispõe sobre a lista de substâncias de ação conservante permitidas para produtos
de higiene pessoal, cosméticos e perfumes e internaliza a resolução GMC
MERCOSUL n° 35/20. Além de indicar as substâncias permitidas, a resolução ainda
fornece a concentração máxima autorizada de uso, limitações, e condições de uso
e advertências.
Para a escolha de conservantes nas formulações cosméticas, primeiro
deve-se avaliar a atividade de água do produto. Cremes e loções apresentam maior
atividade de água e por isso necessitam de um sistema preservante de amplo
espectro, ao contrário dos produtos sólidos como sabonetes em barra, por exemplo.
É necessário também conhecer as propriedades físico-químicas e organolépticas
do conservante a ser utilizado, assim como o momento de adição da substância na
formulação, que no geral é ao final (GUIA ABC MICROBIOLOGIA, 2014).
O conservante ideal deve-se distribuir por todo o sistema, ser compatível
com a formulação e com a embalagem final, ser biodegradável, de baixo custo e
ter amplo espectro de ação com a menor dosagem possível. Entretanto não existe
um conservante ideal que reúna todas essas propriedades e por isso a maioria dos
43
sistemas conservantes comerciais utilizados são associações de diferentes
substâncias (GUIA ABC MICROBIOLOGIA, 2014).
Os parabenos (ésteres de ácido p-hidroxibenzóico), que são utilizados nas
indústrias a mais de 70 anos, são os conservantes mais discutidos do momento em
relação a sua segurança, tanto por consumidores quanto por pesquisadores
(FRANSWAY et al., 2019). Seu frequente uso se dá por apresentar largo espectro
antimicrobiano, não possuir cor nem odor, apresentar estabilidade em ampla faixa
de pH e altas temperaturas, solubilidade em água, serem biodegradáveis e de baixo
custo (NOWAK et al., 2018). Estudos mostram que os parabenos não apresentam
grande potencial irritativo para a pele, raramente causam alergias, e nem a
sensibilizam, além de não apresentarem evidências de acúmulo no organismo.
Entretanto, alguns estudos mostram a relação dos parabenos com o sistema
endócrino e possíveis efeitos em atividades hormonais. Ainda assim, continuam
sendo uma classe segura para a sua utilização, sendo a mais antiga utilizada como
conservantes e a mais estudada (HALLA et al., 2018; HARLEY et al., 2019; NOWAK
et al., 2018). No entanto, os consumidores apresentam preconceito com a
utilização dessas substâncias e por isso a indústria de cosméticos adotou em sua
rotulagem apelos como “livre de parabenos”, “paraben free”, e está na busca de
novos compostos conservantes aceitos pelos consumidores, de preferência,
produtos mais naturais e menos sintéticos, como é o caso dos OEs (ANDRYS,
ADASZYŃSKA-SKWIRZYŃSKA, KULPA, 2018).
44
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 SELEÇÃO E OBTENÇÃO DOS BLENDS DE OEs
Os Blends escolhidos foram desenvolvidos por FÉDERLE (2018), que
selecionou os OEs que demonstraram maior evidência científica de potencial
atividade antimicrobiana, antioxidante e melhor desempenho em testes sensoriais
olfativos. Esses blends passaram também por uma análise de segurança das suas
combinações, segundo o Código de Práticas IFRA (IFRA, 2015), com análise de
moléculas com restrição presente em cada OE e sua respectiva concentração
máxima permitida a partir de avaliação de seus compostos químicos presentes. Os
blends utilizados para o desenvolvimento das NEs e as concentrações de cada OE
em cada um deles está demonstrado na TABELA 1.
O OE de canela foi escolhido para o desenvolvimento de uma NE e comparação
com os blends.
TABELA 1 - BLENDS UTILIZADOS E AS CONCENTRAÇÕES DE CADA OE EM %p/p
ÓLEO ESSENCIAL
BLEND 1
BLEND 3
Anis (Illicium verum Hook. f.)
15,0%
15,0%
Canela (Cinnamomum verum J. Presl)
3,0%
3,0%
Cravo (Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M. Perry)
7,0%
7,0%
Menta (Mentha spicata L.)
32,5%
25,0%
Orégano (Origanum vulgare L.)
32,5%
40,0%
Tomilho (Thymus vulgaris L.)
10,0%
10,0%
TOTAL
100,0%
100,0%
FONTE: A autora (2022).
Os OEs foram fornecidos pela Casa de Fragrâncias Firmenich®, obtidos
por destilação a vapor. Por questões de sigilo industrial, não é possível descrever
o local de origem de cada OE. Os OE foram armazenados em frascos de vidro
âmbar em geladeira (4°C±0,5°C) protegidos da luz.
3.2 DESENVOLVIMENTO DAS NANOEMULSÕES
As NEs dos blends e do OE de canela foram desenvolvidas por meio de
homogeneização sobre alta agitação, baseadas no método de Gündel e
colaboradores (2020) com algumas modificações. A fase oleosa foi constituída de
45
5% do Blend de OE em questão ou apenas o OE de canela, e 2% de sorbitano
monooleato (Span 80 – Sigma Aldrich, USA), enquanto a fase aquosa formada de
2% de polissorbato 80 (Tween 80 – Sigma Aldrich, USA) e 91% de água ultrapura.
As fases, depois de pesadas, foram homogeneizadas separadamente
utilizando um agitador magnético (Solab, Agitador Magnético com Aquecimento SL
– 95, Brasil e Deluq, Agitador Magnético DL310-1P, Brasil), por 15 minutos a 1.800
rpm. A fase aquosa, após agitação, foi submetida a homogeneização no
equipamento Ultra Turrax® (IKA® Works do Brasil, T18 basic, Brasil) por 10
minutos, à 10.000 rpm em banho de gelo e, posteriormente, a fase oleosa foi
injetada de duas maneiras diferentes, obtendo dois desenvolvimentos diferentes,
sendo nas proporções de 1 gota/min (utilizando uma seringa) ou 1 mL/min
(utilizando agulha e seringa) e mantendo agitação por 30 minutos, à 18.000 rpm.
As amostras foram colocadas em frascos de vidro transparente e mantidas a
temperatura ambiente. A FIGURA 8 mostra as NEs obtidas pelo método em
questão.
Foram desenvolvidas também NEs pelo método de Duarte et al. (2015), a
fim de comparar com as NEs desenvolvidas pelo método de Gundel et al. (2020).
Nesta metodologia a fase aquosa é composta por 90% (p/p) de água e a fase oleosa
apresenta 5% dos Blends (1 ou 3) e 5% de Polissorbato 20 (p/p). A fase oleosa é
submetida a homogeneização em agitador magnético a 800 RPM durante 30 min.
Após este tempo, a água foi adicionada gota a gota numa taxa de 3,5 mL/min e a
mistura permaneceu em agitação a 800 RPM durante 60 min.
FIGURA 8 - NANOEMULSÕES DESENVOLVIDAS PELO MÉTODO DE GUNDEL E
COLABORADORES (2020)
FONTE: A autora (2022).
46
NOTA: Amostras obtida com o OE de canela: 1 gota/min (F2C) e 1mL/min (F2Ca). Amostras obtidas
com o blend 1: 1 gota/min (F2B1) e 1mL/min (F2B1a). Amostras obtidas com o blend 3: 1 gota/min
(F2B3) e 1 mL/min (F2B3a).
3.3 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOEMULSÕES
3.3.1 Tamanho de gotícula e índice de polidispersão
O tamanho de gotícula e o índice de polidispersão (IPD) das NEs foram
determinados utilizando a técnica de espalhamento dinâmico de luz (Zetasizer®,
nano-zs,modelo ZEN 3600, Malvern), analisadas no ângulo de 173°, nos tempos
1, 7, 30, 60 e 90 dias, após diluir as amostras em água ultrapura de forma a obter
as concentrações mostradas na TABELA 2.
TABELA 2 - CONCENTRAÇÕES DE PREPARO DAS AMOSTRAS PARA OS ENSAIOS DE
TAMANHO DE GOTÍCULA, ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO E POTENCIAL ZETA
AMOSTRA
CONCENTRAÇÃO (μL/mL)
F2C
10
F2Ca
10
F2B1
3
F2B1a
3
F2B3
1
F2B3a
1
FONTE: A autora (2022).
3.3.2 Potencial Zeta
O potencial zeta foi determinado pela técnica de mobilidade eletroforética
(Zetasizer®, nano-zs,modelo ZEN 3600, Malvern) nos intervalos 1, 7, 30, 60 e 90
dias, após diluição das amostras em água ultrapura obtendo as mesmas
concentrações mostradas na TABELA 2.
3.3.3 Determinação do pH
O pH das NEs foi determinado por potenciometria (Mpa – 210 Tecnopon,
Piracicaba - SP) nos intervalos 1, 7, 30, 60 e 90 dias, e as leituras foram realizadas
diretamente nas formulações à 25°C.
47
3.3.4 Determinação da densidade
A densidade das NEs e dos blends 1 e 3, foram realizadas por picnômetro
de vidro de 5 mL (Qualividros, Passos - MG) nos intervalos 1, 7, 30, 60 e 90 dias.
As pesagens do picnômetro vazio, com água destilada e com as amostras foram
realizadas em balança analítica AG200 (Gehaka, São Paulo-SP). Os valores de
densidade foram calculados por meio da fórmula apresentada na FIGURA 9 (FB,
2019).
FIGURA 9 - FÓRMULA DA DENSIDADE UTILIZADA PARA CÁLCULO
FONTE: Adaptado de FARMACOPEIA
BRASILEIRA 6ª ED (2019).
3.3.5 Morfologia das Nanoemulsões
A visualização da morfologia das NEs dos blends foi realizada pela técnica
de microscopia eletrônica de varredura em microscópio TESCAN VEGA3 LMU
(Brno - República Tcheca). As amostras F2B1 e F2B3 foram observadas 60 dias
após seu desenvolvimento e as amostras F2B1, F2B1a, F2B3 e F2B3a após 150
dias. As amostras foram colocadas em suporte de metal contendo uma fita dupla
de cobre e preparadas usando metalização com ouro conforme indicado por
(KLANG et al., 2012). As imagens de cada amostra foram capturadas nas
magnificações de 1.00 kx, 15.0 kx e 30.0 kx, usando um potencial de aceleração
de 15 kV sob baixo vácuo. A análise das imagens foi realizada no software Vega,
versão TC (Tescan, Brno, República Tcheca), com o detector de elétrons
secundário.
48
3.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS
NANOEMULSÕES
A atividade antimicrobiana das NEs foi avaliada pelo método de
microdiluição seriada em caldo validado por Veiga (2019).
Cepas padrão dos microrganismos Escherichia coli (ATCC 8739),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e
Candida albicans (ATCC 10231) foram utilizadas para este estudo. Os micro-
organismos foram padronizados conforme o teste de eficácia antimicrobiana
descrito na Farmacopeia Brasileira (6ª edição).
Inicialmente procedeu-se a revitalização das células por meio da
inoculação dos microrganismos liofilizados em caldo triptona de soja (TSB) seguido
de incubação à 35ºC/24h. Após esse período, as culturas de bactérias obtidas
foram semeadas por esgotamento em ágar triptona de soja (TSA / 35 ºC / 24h) e a
cultura da levedura C. albicans em ágar sabouraud à 25 °C / 48h.
As colônias isoladas foram transferidas para tubos de ensaio contendo
solução salina de NaCl 0,9% de forma a obter a turbidez correspondente a 0,5 da
Escala de McFarland que corresponde a um inóculo de 1,5x108 UFC/mL no
equipamento densitômetro (Densimat Biomérieux Biotechnology).
Foram testados os OEs e suas respectivas NEs nos tempos 30 e 90 dias
após o preparo com exceção das amostras com OE de canela (F2C e F2Ca) e o
OE de canela puro, que foram avaliados apenas no tempo de 30 dias.
As NEs (F2C, F2Ca, F2B1, F2B1a, F2B3 e F2B3a) foram testadas puras,
sendo o volume de 100 μL pipetado na fileira A e nos seus respectivos brancos,
sendo considerada a concentração de Blend presente na formulação (5% (p/p) =
50 mg/mL, sendo 25 mg/mL no primeiro poço).
O preparo da amostra do OE de canela puro envolveu a diluição do mesmo
em caldo Mueller Hinton para as bactérias e caldo Sabouraud para a levedura,
sendo adicionados no primeiro poço com concentração de 2 μL/mL para as
bactérias e 4 μL/mL para a levedura. As soluções foram preparadas no momento
da realização do experimento, nas concentrações de 4 μL/mL e de 8 μL/mL,
respectivamente (FEDÉRLE, 2018). No ensaio do tempo de 30 dias, todas as
amostras utilizaram o metilparabeno (MP) como referência por este ser um dos
conservantes sintéticos mais utilizado na indústria de cosméticos e por ser um dos
49
alvos de substituição. O MP foi utilizado na concentração de 4 μg/mL (primeiro
poço) para todos os micro-organismos (FEDÉRLE, 2018).
Os ensaios foram realizados em microplacas de 96 poços com fundo em “U”.
Somente um microrganismo foi testado em cada placa a fim de evitar uma
contaminação cruzada.
Em cada microplaca de avaliação de bactérias, todos os poços utilizados
foram preenchidos com 100 μL de caldo Mueller Hinton e os poços das microplacas
de avaliação da levedura Candida albicans com 100 μL de Caldo Sabouraud
Dextrose. Em seguida, 100 μL das amostras com concentrações conhecidas foram
adicionados nos poços da fileira A em duplicata e/ou triplicata.
Posteriormente, foram realizadas as diluições seriadas, proporções: 1:2,
1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256. Com auxílio de uma pipetadora multicanal,
os poços da fileira A foram homogeneizados e procedeu-se a transferência de uma
alíquota de 100 μL para a fileira seguinte (fileira B), e esse procedimento de
homogeneização e transferência foi sendo feito até a fileira H, onde por fim, 100 μL
de cada poço foi descartado.
Soluções padrões de cetoconazol e cloranfenicol foram preparadas para
serem utilizadas como controle positivo para a levedura e bactérias,
respectivamente. Os padrões puros, na forma de pó, foram pesados em balança
analítica AG200 (Gehaka, São Paulo-SP) e solubilizados em água destilada estéril
de modo a obter as concentrações de 500 μg/mL para o cetoconazol e 250 μg/mL
de cloranfenicol. Os poços do controle positivo foram preenchidos com 100 μL do
caldo Sabouraud ou Mueller Hinton e 100 μL da solução de cetoconazol ou
cloranfenicol para inibição do crescimento da levedura e bactérias,
respectivamente.
Como controle negativo, os poços receberam 100 μL de caldo Sabouraud
ou Mueller Hinton e 100 μL de água destilada estéril.
Para os poços considerados branco do controle negativo foi utilizado 100
μL de caldo Mueller Hinton ou caldo Sabouraud e 100 μL de água destilada estéril.
Como branco, os poços foram preenchidos com 100 μL de caldo e 100 μL
das amostras a serem testadas sem adição de microrganismos.
Como o Span 80 e o Tween 80 fazem parte da composição das NEs,
controles destas substâncias foram realizados. Os poços correspondentes a esses
controles receberam 100 μL do respectivo caldo e 100 μL de solução de Span 80
50
ou Tween 80 a 4%, para que nos poços as substâncias ficassem na mesma
concentração encontrada nas formulações das NEs, ou seja, 2% (p/p).
Por fim, foram então adicionados 10 μL da suspensão de micro-organismos
em cada orifício, exceto nos poços correspondentes ao branco, que receberam 10
μL de salina para mimetizar a adição do inóculo.
Como indicador visual de crescimento microbiano, foi utilizado o cloreto de
2, 3, 5 trifeniltetrazólio (TCC) preparado em água destilada estéril na concentração
de 0,125%. A solução obtida foi filtrada por membrana esterilizante (0,20μm) e
armazenada em frascos estéreis recobertos com papel alumínio sob refrigeração
(2 a 8°C).
As microplacas foram incubadas à 35ºC ± 0,5°C durante 22 horas. Após a
incubação, 20 μL de solução de TTC 0,125% foram adicionados em todos os poços.
A análise qualitativa (verificação de cor) contemplou a visualização e
interpretação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) após 2 horas da adição
do TTC. Foi considerado como CIM a concentração do último poço de A até H em
que não ocorreu crescimento microbiano.
Na FIGURA 10, podemos observar um esquema da microplaca com setas
que indicam a passagem de 100 μL para o próximo poço ou descarte.
FIGURA 10 – ESQUEMA DA DILUIÇÃO SERIADA EM MICROPLACA
FONTE: VEIGA (2016).
NOTA: As cores representadas em azul escuro na fileira A mostram a amostra na sua concentração
inicial e à medida que vai clareando, para azul claro a branco, indica a diluição da amostra. Na fileira
12, em amarelo estão representados esquematicamente os controles.
51
3.5 DESENVOLVIMENTO DE UMA EMULSÃO PARA APLICAÇÃO DAS
NANOEMULSÕES DOS BLENDS DE ÓLEOS ESSENCIAIS
A formulação da emulsão escolhida foi gentilmente disponibilizada por uma
indústria de cosméticos e perfumaria, situada em Pinhais no Paraná. Trata-se de
um creme hidratante cuja formulação está apresentada na TABELA 3.
TABELA 3 - FÓRMULA DO CREME HIDRATANTE ESCOLHIDO E QUANTIDADE EM G
COLOCADA PARA A PRODUÇÃO DE 510 G
FASE
INCI NAME %
QUANTIDADE
(g)
A
A
A
A
A
Aqua
40,0
204,0
Dissodium EDTA
0,05
0,255
Aminomethyl Propanol
0,04
0,204
Propylene Glycol
1,0
5,10
Urea
2,0
10,20
B
B
B
B
B
B
BHT
0,10
0,510
Stearic Acid
3,0
15,30
Glyceryl Stearate
3,0
15,30
Cetearyl Alcohol
3,0
15,30
Ceteareth-20
1,3
6,63
Paraffinum Liquidum
1,0
5,10
C
Aqua
42,79
218,229
D
D
Lactic Acid
0,02
0,102
Aqua
1,0
5,10
E
*Methylparaben (and) Ethylparaben
(and) Propylparaben (and)
Butylparaben (and) Phenoxyethanol
0,30
1,53
E
Aqua
1,40
7,14
TOTAL
100,0
510
FONTE: Adaptado da INDÚSTRIA DE COSMÉTICOS (2022).
* Nome Comercial: Phenochem NIB.
No desenvolvimento da emulsão, a fase A e a fase B foram pesadas
separadamente em balança analítica AG200 (Gehaka, São Paulo-SP) e
submetidas a aquecimento entre 70°C e 80°C em uma chapa aquecedora (Solab
SL-141). Ao atingir esta temperatura, a fase B foi cuidadosamente vertida sobre a
fase A, sob constante homogeneização feita com bastão de vidro. A fase C foi
adicionada bem lentamente e sob agitação constante. A fase D foi pesada,
misturada e adicionada lentamente sobre as demais fases. Quando a temperatura
52
atingiu 40°C, a fase E ou as NEs dos blends dos OEs foram adicionados nas suas
devidas proporções e homogeneizados para completa incorporação.
Portanto, foram manipulados 510 g desta emulsão sem conservante, a qual
foi fracionada conforme mostrado na TABELA 4.
TABELA 4 - FRACIONAMENTO DA EMULSÃO
Quantidade
de emulsão
(g)
Concentração do
conservante
(%)
Quantidade do
conservante
(g)
Conservante
65
-
-
-
65
0,3%
0,195
*Phenochem NIB
25
0,3%
0,075
F2B1
25
0,3%
0,075
F2B3
25
0,5%
0,125
F2B1
25
0,5%
0,125
F2B3
65
1,0%
0,65
F2B1
65
1,0%
0,65
F2B3
25
2,0%
0,50
F2B1
25
2,0%
0,50
F2B3
25
2,5%
0,625
F2B1
25
2,5%
0,625
F2B3
FONTE: A autora (2022).
* Methylparaben (and) Ethylparaben (and) Propylparaben (and) Butylparaben (and)
Phenoxyethanol.
Devido aos melhores resultados de atividade antimicrobiana obtidos no
experimento de microdiluição, as NEs de menor tamanho de gotícula (F2B1 e F2B3
nas concentrações de 1%) foram escolhidas para serem aplicadas na emulsão
cosmética para proceder o ensaio do desafio do poder conservante (Challenge
Test). A escolha corroborou com estudos encontrados na literatura que relatam que
NEs de menor tamanho apresentam maior atividade antimicrobiana (GUO et al.,
2020; HORVÁTH et al., 2019).
As NEs foram adicionadas na emulsão nas concentrações mencionadas
para atuarem como conservante da formulação. As porções fracionadas foram
armazenadas em frascos a temperatura ambiente (25 ºC). As quantidades do
fracionamento foram calculadas com base na quantidade de amostra (emulsão)
necessária para os ensaios de challenge test (desafio do poder conservante) e
estabilidade.
53
3.5.1 Teste do desafio do poder conservante (Challenge Test)
O Challenge Test foi realizado de acordo com o que é preconizado pela
Farmacopeia Brasileira 6ª edição (2019) e pelo guia ABC de Microbiologia 5ª edição
(2017), com algumas modificações.
Foram utilizados para o estudo os micro-organismos gram negativos
Pseudomonas aeuginosa (ATCC 9027) e Escherichia coli (ATCC 8739); gram
positivo Staphylococcus aureus (ATCC 6538); A levedura Candida albicans
(ATCC10231) e o fungo filamentoso Aspergillus brasiliensis (ATCC16404).
Para o preparo do inóculo, os micro-organismos liofilizados foram
colocados em tubos contendo caldo triptona de soja (TSB) para revitalização das
células. As bactérias foram incubadas à 35ºC/24h e os fungos à 25°C/48h. Após o
período de incubação, os cultivos das bactérias foram semeados por esgotamento
em ágar triptona de soja (TSA) e incubados à 35ºC/24h, enquanto os cultivos dos
fungos em ágar Sabouraud incubados à 25°C/48h.
Alíquotas das colônias obtidas foram transferidas para tubos contendo
solução salina 0,9% (NaCl) seguido de agitação em vórtex de forma a obter a
turbidez correspondente a 0,5 na Escala de McFarland (#1,5x108 UFC/mL) medida
no equipamento densitômetro (Densimat Biomérieux Biotechnology). Em seguida,
duas diluições seriadas foram feitas para cada microrganismo, ou seja, 1 mL de
cada uma das suspensões microbianas foi transferido para um tubo contendo 9 mL
de solução salina estéril para obter a concentração de 1,5x107 UFC/mL, sendo o
procedimento repetido mais uma vez a fim de obter a concentração de 1,5x106
UFC/mL. para que a concentração final no produto fosse de 1,5x105 UFC/mL,
conforme especificação farmacopeica. A partir destas, a fim de otimizar os ensaios
de challenge test, foram preparados pools (misturas) destes micro-organismos da
seguinte forma: o pool bacteriano foi obtido a partir da mistura de 1 mL de cada
uma das suspensões bacterianas as quais foram transferidas para um tubo vazio
estéril seguido de homogeneização em vórtex. Em outro tubo estéril, 1 mL da
suspensão da levedura e 1 mL da suspensão do fungo filamentoso foram
misturadas dando origem ao pool dos fungos.
O challenge test foi feito nas formulações, com conservante (Phenochem
NIB); sem conservante; com 1% de F2B1 e com 1% de F2B3. Para cada formulação
foram utilizados dois frascos de vidro estéreis cada um deles contendo 20g da
54
mesma. Um destes frascos foi desafiado (inoculado) com 200 μL do pool de
bactérias e o outro com o pool de fungos, perfazendo uma concentração final no
produto de 3,0x105 UFC/mL destes microrganismos.
Essas amostras foram homogeneizadas com bastão de vidro estéril e
incubadas em estufa a 22,5°C ± 2,5°C. A avaliação do potencial antimicrobiano de
cada formulação foi feita por meio da contagem de microrganismos em placas nos
tempos zero, 7, 14 e 28 dias. Após a realização do ensaio de 7 dias as amostras
foram contaminadas com mais 200 μL dos pools, separadamente.
No tempo zero (T0), imediatamente após a inoculação dos microrganismos
nos frascos, 1 g do produto contaminado foi amostrado em tubo de ensaio estéril
contendo 9 mL de caldo Triptona-Azolectina-Tween (Caldo TAT) cuja composição
possui o agente neutralizante do conservante (Polissorbato 20 + compostos). O
tubo foi submetido a agitação em vórtex, obtendo-se a primeira diluição (10-1). Em
seguida, 1 mL da primeira diluição foi transferida para outro tubo contendo 9 mL de
salina estéril (0,9%), submetido a agitação em vórtex, obtendo-se a segunda
diluição (10-2), e assim sucessivamente até a obtenção da sexta diluição (10-6).
Seguidamente, as diluições 10-6, 10-5 e 10-4 foram plaqueadas em placas
de Petri estéreis, cada uma delas em duplicata, utilizando o método de semeadura
em profundidade (Pour Plate): 1 mL da diluição foi transferida para o centro da placa
de Petri seguido da adição de cerca de 20 mL de ágar TSA para as amostras
contaminadas com o pool de bactérias e 20 mL de ágar Sabouraud Dextrose para
as amostras contaminadas com o pool de fungos. As placas foram
homogeneizadas lentamente com movimentos em “8”, e incubadas a 32,5 ±
2,5°C/24h para as bactérias e a 25,0 ± 2,5°C/48h para os fungos.
O plaqueamento utilizando o método Pour Plate foi repetido da mesma
forma para os tempos de 7, 14 e 28 dias e em cada tempo uma diluição a mais era
plaqueada, exceto para amostra sem conservante. A FIGURA 11 mostra a
metodologia.
Os resultados foram expressos em UFC/g do produto através da média e
desvio padrão das contagens obtidas em duplicata.
55
FIGURA 11 - METODOLOGIA CHALLENGE TEST
FONTE: A autora (2022).
3.5.2 Estudo de estabilidade de emulsão com nanoemulsões de blends de OEs
Os cremes com 0,3%, 0,5%, 1%, 2% e 2,5% de cada NE avaliada (F2B1 e
F2B3), foram acondicionados em potes de vidro com 1/3 do seu volume vazio como
preconizado pelo guia de estabilidade de produtos cosméticos da ANVISA (2004).
Estes foram deixados a temperatura ambiente 25,0 ± 2,0°C e avaliados no
tempo 0, 30, 60 e 90 dias quanto a parâmetros organolépticos (cor, odor, aspecto
e sensação ao tato), parâmetro físico-químico (pH), realizado por potenciometria
(Mpa – 210 Tecnopon, Piracicaba - SP) diretamente nas formulações, e parâmetros
microbiológicos (contagem microbiana).
Em cada um dos tempos avaliados, 1 g do produto foi amostrado em tubo
de ensaio estéril contendo 9 mL de caldo TAT. O tubo foi submetido a agitação em
vórtex, obtendo-se a primeira diluição (10-1). Em seguida, 1 mL da primeira diluição
foi transferida para outro tubo contendo 9 mL de salina estéril (0,9%), submetido a
agitação em vórtex, obtendo-se a segunda diluição (10-2), e assim sucessivamente
até a obtenção da sexta diluição (10-6).
Seguidamente, as diluições 10-6, 10-5 e 10-4 foram plaqueadas em placas
de Petri estéreis, cada uma delas em duplicata, utilizando o método de semeadura
56
em profundidade (Pour Plate): 1 mL da diluição foi transferida para o centro da placa
de Petri seguido da adição de cerca de 20 mL de ágar TSA para crescimento de
possíveis bactérias e 20 mL de ágar Sabouraud Dextrose para avaliação de
crescimento de fungos. As placas foram homogeneizadas lentamente com
movimentos em “8”, e incubadas a 32,5 ± 2,5°C/24h para as bactérias e a 25,0 ±
2,5°C/48h para os fungos.
Os resultados foram expressos em UFC/g do produto através da média e
desvio padrão das contagens em duplicata.
3.6 COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS, FLAVONÓIDES TOTAIS E
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
As amostras F2B1, F2B1a, F2B3 e F2B3a, foram avaliadas quanto aos
teores de compostos fenólicos totais, flavonóides totais e atividade antioxidante
após 1 e 90 dias dos seus desenvolvimentos. Os blends 1 e 3 também foram
avaliados a nível de comparação.
Os extratos foram preparados em tubo Falcon pela mistura de 300 μL das
amostras com 0,9 mL de metanol 80%. Esta mistura foi submetida a agitação em
vórtex por 4 minutos, seguido de centrifugação por 5 minutos a 3000 RPM em
centrífuga (Sigma, 4K15, Alemanha) e o sobrenadante foi recolhido. Esse processo
foi realizado 3 vezes consecutivas. Os sobrenadantes foram combinados e
armazenados em geladeira (4 ± 2°C).
Para a realização dos testes os extratos foram diluídos em metanol a 80%.
Os blends 1 e 3 foram analisados na concentração de 0,05 mL/mL e as NEs a 1,67
mL/mL.
Foram utilizadas microplacas de 96 poços e a absorbância foi medida em
espectrofotômetro de microplacas (Multiscan FC, Thermo Scientific, Shangai,
China) para todas as análises. Para o potencial atividade antioxidante, o trolox
equivalente (0,0016 – 1,6 mmol/mL) foi utilizado como padrão e os resultados foram
expressos em mmol equivalente de trolox (ET)/mL e calculados a partir das suas
respectivas curvas de calibração.
3.6.1 Compostos fenólicos totais (CFT)
57
A metodologia empregada foi a de Singlenton e Rossi (1965). O ácido
gálico foi utilizado como padrão nas concentrações de 0,0500, 0,0875, 0,1000,
0,1750, 0,2000, 0,3500, 0,4000, 0,7000, 0,8000, 1,4000 mg EAG/mL.
Primeiramente, foi adicionado 240 μL de água destilada, 10 μL da amostra
ou do padrão e 15 μL de reagente Folin-Ciocalteau filtrado. A microplaca foi
incubada por 3 min no escuro. Após o tempo, foi adicionado 15 μL de carbonato de
sódio (Na2CO3) 20%. No escuro, a microplaca permaneceu por mais 60 minutos e
sua absorbância foi medida em 690 nm. Os resultados foram calculados a partir de
dados da curva de calibração e expressos em mg eq. de ácido gálico (EAG)/mL.
3.6.2 Análise de flavonoides totais (FT)
O ensaio de FT foi realizado de acordo com Jia (1999). A catequina foi
utilizada como padrão nas concentrações de 1,0000, 0,4000, 0,2000, 0,1000,
0,0500, 0,0250, 0,0125, 0,00625, 0,003125, 0,0015625, 0,00078125 mg EC/mL.
Foram preparadas as soluções de Nitrito de Sódio 5% (NaNO2), Cloreto de
alumínio 10% (AlCl3) e hidróxido de sódio 1 mol/L.
Foram adicionados 10 μL de amostra nos poços e 90 μL de NaNO2. Em
seguida, 10 μL de AlCl3 foram adicionados. Por fim, 90 μL de NaOH foi adicionado
a microplaca e após 60 minutos em repouso no escuro a absorbância foi medida
em 515 nm. Os resultados foram calculados a partir de dados da curva de
calibração e expressos em mg eq. de catequina (EC)/mL.
3.6.3 DPPH
Para avaliação da capacidade de redução do radical 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH) pelas amostras, a metodologia utilizada foi a descrita por Blois
(1958) modificado por Brand-Williams, Cuvelier e Berset (1995). Em balança
analítica AG200 (Gehaka, São Paulo-SP) foi pesado 0,0048 g de DPPH, sendo
diluídos em balão de vidro âmbar com metanol, obtendo a solução de DPPH a 0,24
mmol/L (PM=349,32). Em microplacas, foram adicionados 190 μL da solução de
DPPH e 10 μL da amostra ou da solução padrão (mmol equivalente de trolox
(ET)/mL). Após 30 minutos em repouso no escuro, a absorbância foi medida em
515 nm.
58
3.6.4 ABTS
De acordo com a metodologia de captura do radical orgânico 2,20-azino-
bis (ácido. 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfônico (ABTS) preconizada por Re (1999),
foram preparadas as seguintes soluções: Solução estoque de ABTS 7mM, onde
foram dissolvidos 192 mg de ABTS em água destilada em balão volumétrico de 50
mL, este foi armazenado sob refrigeração (4 ± 2°C) no escuro; Solução de
persulfato de potássio 140 mM que consistiu na dissolução de 378,4 mg de
persulfato de potássio em água destilada q.s.p 10 mL e armazenado em
temperatura ambiente.
Uma mistura de 5 mL da solução estoque de ABTS com 88 μL da solução
de persulfato de potássio, foi preparada e armazenada à temperatura ambiente por
16 h no escuro. Em seguida a mistura foi diluída em água até a obtenção de uma
absorbância de 0,70 ± 0,05 nm a 734 nm.
Foram adicionados nos poços 300 μL do radical ABTS e 10 μL da amostra
ou solução padrão. Após 30 minutos em repouso no escuro a absorbância foi
medida em 690 nm.
3.6.5 FRAP
O método de FRAP (capacidade de redução do ferro) foi realizado de
acordo com Benzie e Strain (1996). A solução tampão acetato 300 mM de pH 3,63
foi preparada com 1,87 g de acetato de sódio anidro, 16 mL de ácido acético glacial
em um balão volumétrico de 1 L com água destilada. Para a solução de ácido
clorídrico (HCl- PM 36,46), 3,31 mL de HCl concentrado foi colocado em um balão
volumétrico de 1 L com água destilada. Para a solução de cloreto férrico (FeCl3) 20
mM, 0,135 g de FeCl3 foram colocados em balão volumétrico de 25 mL com água
destilada. Para a solução de 2, 4, 6 – tripidil-s-tri-azine (TPTZ) 10 mM, 0,03212 g
de TPTZ foram dissolvidos em 10 mL de HCl 40 mM; e, para a obtenção da solução
de FRAP foram misturados 100 mL de tampão acetato, 10 mL de FeCl3 e 10 mL de
TPTZ 10mM.
59
Foram adicionados 300 μL de solução FRAP em todos os poços e 10 μL
da amostra ou do padrão. Após 30 minutos em repouso no escuro a absorbância
foi medida em 570 nm.
3.7 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE
3.7.1 Cultivo de células
Células da linhagem McCoy (fibroblasto murino - 0160) foram obtidas
comercialmente do Instituto Adolfo Lutz. Essas foram cultivadas em meio RPMI
1640 (GIBCO, Baltimore, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB)
(GIBCO, Baltimore, EUA) e solução de antibióticos contendo penicilina e
estreptomicina (10.000 U/mL – GIBCO, Baltimore, EUA).
As células foram mantidas em estufa, à temperatura de 37°C e em
atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% de umidade.
3.7.2 Avaliação do potencial citotóxico das nanoemulsões por meio do método
da redução do sal de tetrazólio (MTT)
O ensaio de MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2il] -2,5-difenil-2H tetrazolato de
bromo) foi utilizado para avaliar o potencial citotóxico das NEs F2B1, F2B1a, F2B3
e F2B3a e dos blends 1 e 3 frente as células McCoy segundo o método proposto
por Mosmann (1983).
Para o ensaio, as células McCoy foram plaqueadas em microplacas de 96
poços na concentração de 2,0 X103 células/poço, utilizando meio RPMI 1640
suplementado com 10% de SFB. Em seguida as placas foram incubadas em estufa
(37°C e atmosfera de 5% de CO2) por 24 h para adesão das células na placa.
Após esse período, as células foram tratadas por 72 h com diferentes
concentrações (1; 2,5; 5,0; 7,5; e 10 μg/mL) das NEs, dos blends e do veículo das
NEs (formulação sem a fase oleosa), e com o veículo de diluição dos blends
(solução de dimetilsulfóxido (DMSO) a 1% em meio de cultivo completo), para
estabelecer o crescimento celular sem influência de qualquer composto. Como
controle normal, as células foram incubadas com meio de cultivo celular completo.
Após 72 h de incubação, 100μL de uma solução de MTT diluído em meio e cultura
60
(0,5mg/mL) foram adicionados em cada poço. As placas foram incubadas
novamente por mais 2 h. Ao final, o conteúdo de cada poço foi removido com o
auxílio de uma micropipeta e foram adicionados nos poços 100μL de DMSO (PA)
(Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA). As microplacas foram levadas para a
homogeneização em agitador de placas por 5 minutos, seguido de leitura em
espectrofotômetro de microplacas (Multiscan FC, Thermo Scientific, Shangai,
China) a 570 nm.
FIGURA 12 - ESQUEMA DAS MICROPLACAS DE CITOTOXICIDADE
FONTE: A autora (2022).
Foram desenvolvidas duas placas com mostrado na FIGURA 12, e o
experimento foi realizado em quadruplicata e repetido três vezes, a fim de verificar
a reprodutibilidade da resposta.
A redução do sal MTT do grupo controle (CTRL) foi considerada como
100% de viabilidade mitocondrial.
A determinação da porcentagem de células viáveis foi calculada pela fórmula
de Ebada et al. (2008):
As células foram consideradas viáveis quando a viabilidade foi > 60%
conforme considerado por Tavares et al. (2020) para avaliação de segurança e
eficácia de substâncias ativas cosméticas pelo ensaio de MTT.
61
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises de caracterização das NEs foram realizadas em triplicata e
apresentadas como média ± desvio padrão. Os dados foram submetidos a análise
de variância unidirecional (One-way ANOVA) – Microsoft Excel (Versão 2206 Build
16.0.15330.20260 64 bits) seguido de teste de Duncan – SASM-Agri (2001), para
comparação de médias, quando apresentaram diferenças significativas. Para
verificar a diferença entre as médias dos dois blends (1 e 3), o teste t – Action
(versão 2.8.29.357.515, 2014), foi aplicado.
As análises do ensaio do MTT foram realizadas através do software
GraphPad Prisma 6 (San Diego, EUA, versão 9.4.0, 2022) e Microsoft Excel
(Versão 2206 Build 16.0.15330.20260 64 bits). Os resultados foram expressos
como média ± desvio padrão das quadruplicatas de cada experimento. Os dados
foram analisados usando One-way ANOVA (análise de variância unidirecional) e
análise múltipla de Bonferroni para comparação.
62
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 DESENVOLVIMENTO DAS NANOEMULSÕES
Inicialmente foram desenvolvidas NEs por dois métodos: a) Método de
Gundel et al. (2020); b) Método de Duarte et al. (2015). As diferenças das
metodologias são mostradas na TABELA 5. O método de sucesso foi o de Gundel
et al. (2020), onde foram obtidas NEs estáveis, mostradas na FIGURA 13, por um
período de 1 ano (acompanhamento durante o desenvolvimento deste trabalho).
Na FIGURA 14, podemos ver as formulações desenvolvidas pelo método de Duarte
et al. (2015) após 3 dias de preparo. As seguintes modificações foram realizadas
no método de sucesso afim de analisar possíveis alterações de tamanho de
gotículas sendo elas: I) Fase oleosa adicionada a fase aquosa com seringa a
1gota/min; II) Fase oleosa adicionada com agulha acoplada a seringa a 1mL/min.
TABELA 5 - FORMULAÇÃO, MÉTODO E CONCLUSÃO DOS DESENVOLVIMENTOS DE NE
FORMULAÇÃO
GUNDEL et al., 2020
DUARTE, et al., 2015
Água
91% (p/p)
90 % (p/p)
Óleo Essencial
5% (p/p) (Eucalipto e Capim e limão)
5% (p/p) (Alecrim)
Tensoativo
Span 80 2% (p/p) / Tween 80 2% (p/p)
Polissorbato 20 5% (p/p)
MÉTODO
Alta energia
Baixa energia (Inversão
de fase)
CONCLUSÃO
Sem separação de fase e/ou outro tipo de
alteração ao longo de 9 meses
Separação de fase
FONTE: GUNDEL et al. (2020); DUARTE et al. (2015).
FIGURA 13 - NANOEMULSÕES PELO MÉTODO DE GUNDEL et al. (2020).
FONTE: A autora (2022).
63
LEGENDA: F2C: NE com OE de canela (seringa); F2Ca: NE com OE canela
(agulha); F2B1: NE com o Blend 1 (seringa); F2B1a: NE com o Blend 1 (agulha);
F2B3: NE com Blend 3 (seringa); F2B3a: NE com Blend 3 (agulha).
Foram escolhidos estes métodos porque eles permitem obter NEs com
uma carga de 5% de OE e, também por serem diferentes quanto a energia
necessária e tensoativos utilizados na formulação. Estudos prévios de Féderle
(2018), mostraram que é necessário 5% dos blends na formulação para que a
mesma ofereça atividade antimicrobiana utilizando pouca quantidade de NEs.
Na NEs com apenas um OE, o de canela foi o selecionado, por ser o
segundo OE que mais apresentou atividade antimicrobiana equivalente ao
metilparabeno (MP) em experimentos de eficácia antimicrobiana, ficando atrás do
OE de tomilho, que não foi escolhido por apresentar baixa agradabilidade, o OE de
canela também apresentou atividade antioxidante igual ou superior ao BHT e boa
aceitabilidade no teste sensorial.
FIGURA 14 – NANOEMULSÕES DESENVOLVIDAS
PELO MÉTODO DE DUARTE et al. (2015)
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: F1C: NE com OE de canela; F1B1: NE com
o Blend 1; F1B3: NE com blend 3.
As formulações apresentaram fenômenos de instabilidade, como
separação de fases, sendo observada uma sedimentação no caso de F1C e
cremeação em F1B1 e F1B3. A sedimentação em F1C é demonstrada pelas
gotículas da fase oleosa presentes no fundo do frasco e a cremeação ocorre devido
a diferença de densidade entre a fase dispersa e a dispersante da NE, ou seja,
quando a fase dispersa é menos densa do que a fase dispersante as gotículas
64
formam um “creme” na região superior da amostra como mostrado na FIGURA 14
(ONUKI et al., 2014).
O método de inversão de fases é um método de baixa energia que tem
tendência a apresentar gotículas de tamanhos maiores e polidispersas o que leva
a instabilidade da formulação. Quanto menores são as gotículas, mais estável é o
sistema, as partículas estão menos sujeitas a sedimentação e coalescência devido
a redução da ação da força gravitacional sobre as mesmas. Neste caso, o
movimento Browniano realizado naturalmente supera a gravidade (RAI et al., 2018;
ROLLAND et al., 2021). O método de Gündel (2020), utiliza alta energia em seu
desenvolvimento através do equipamento Ultra turrax. Os métodos de alta energia
são conhecidos por proporcionarem gotículas pequenas e pouco polidispersas
(MOHD ZAFFARIN et al., 2020), neste caso, sendo eficiente para acomodar as
gotículas da fase oleosa dos blends que apresentam 6 OEs entre os tensoativos
Span 80 e Tween 80.
Outra vantagem do método de sucesso é a não utilização de solventes
orgânicos e nenhuma fonte de calor ou aquecimento que possa estar levando a
evaporação de compostos voláteis dos OEs da formulação, sendo mais sustentável
do que outros (DE GODOI et al., 2017; GÜNDEL et al., 2020).
Os tensoativos utilizados também influenciam na estabilidade da NE,
interferem no tamanho e na polidispersão das gotículas. No método de Duarte et
al. (2015), apenas um tensoativo foi utilizado, o Tween 20, biocompatível, visto em
diversas aplicações farmacêuticas. Assim como o Tween 80 e o Span 80, é
classificado como não-iônico e tem a capacidade de dispersar partículas
hidrofóbicas em soluções aquosas (LIANG et al., 2020). Esses tensoativos são
mostrados na figura 15, contudo e de acordo com Foo et al. (2020) o uso combinado
de tensoativos que apresentam EHL diferentes contribuem para a obtenção de NEs
mais estáveis. Isso comprova-se no método de Gundel et al. (2020), que
apresentou NEs estáveis e utiliza Tween 80 e Span 80, esses apresentam valores
de EHL de 15 (mais hidrofílico) e 4,3 (mais lipofílico), respectivamente. Esses
valores são importantes para a escolha dos tensoativos presentes na formulação,
garantindo a estabilidade das NEs pela interação interfásica estabelecida entre as
fases imiscíveis. Como mostrado na FIGURA 15, essas moléculas apresentam
diferenças de comprimento de cadeia e isso é o que estabelece o EHL e a
solubilidade do tensoativo (FOO et al., 2020).
65
Os tensoativos do método escolhido também apresentam vantagens em
relação aos seus efeitos de permeabilidade em membranas biológicas, o que é
vantajoso para a utilização em uma formulação destinada a atuar em micro-
organismos, e ainda apresentam baixo potencial de irritação e baixa toxicidade,
sendo assim bons candidatos para produtos cosméticos (SINGH et al., 2019).
Segundo Gündel (2018), o Tween 80 é mais efetivo em reduzir o tamanho
das gotículas, oferecendo maior estabilidade para as formulações ao contrário do
Tween 20. Tian (2016) desenvolveu NE com citral utilizando Tween 20 e obteve NE
com gotículas em torno de 400 nm estáveis por apenas 14 dias.
FIGURA 15 - TWEEN 20, TWEEN 80 E SPAN 80 (NOME, ESTRUTURA MOLECULAR E EHL)
FONTE: Adaptado de MAHDI et al. (2011).
4.2 TAMANHO DE GOTÍCULA E ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO
66
O tamanho e o índice de polidispersão (IPD) das NEs foram avaliados nos
intervalos de 1, 7, 30, 60 e 90 dias e os resultados são mostrados nas TABELAS 6
e 7.
67
TABELA 6 – TAMANHO (nm) E DESVIO PADRÃO DAS NANOEMULSÕES
Código
Formulação
1 dia 7 dias 30 dias 60 dias 90 dias
p
-
valor
F2C
106,9 ± 0,70b E
91,6 ± 0,50c F
108,1 ± 0,34b E
151,0 ± 0,26a C
150,3 ± 1,67a D
<0,0001
F2Ca
120,6 ± 1,95c D
100,4 ± 0,37e E
114,8 ± 0,70d D
169,8 ± 0,25b B
181,7 ± 0,70a C
<0,0001
F2B1
121,8 ± 0,90a D
103,5 ± 1,22c D
100,6 ± 1,13d F
108,4 ± 0,94b D
103,0 ± 0,25c F
<0,0001
F2B1a
163,7 ± 1,53b C
146,1 ± 1,24d B
149,4 ± 1,42c B
168,7 ± 1,30a B
119,4 ± 0,95e E
<0,0001
F2B3
177,5 ± 1,19b B
137,2 ± 2,47d C
135,6 ± 1,40d C
169,3 ± 1,49c B
190,5 ± 0,55a B
<0,0001
F2B3a
230,4 ± 1,42d A
229,7 ± 0,60d A
251,6 ± 0,70c A
274,6 ± 1,96b A
285,9 ± 0,70a A
<0,0001
p-valor
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: F2C: NE com OE de canela (seringa); F2Ca: NE com OE canela (agulha); F2B1: NE com o Blend 1
(seringa); F2B1a: NE com o Blend 1 (agulha); F2B3: NE com Blend 3 (seringa); F2B3a: NE com Blend 3 (agulha); De
acordo com teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras maiúsculas entre colunas denotam diferenças significativas
entre as amostras (n = 3) e diferentes letras minúsculas entre linhas denotam diferenças significativas entre os tempos.
TABELA 7 - ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO E DESVIO PADRÃO DAS NANOEMULSÕES
Código
Formulação
1 dia 7 dias 30 dias 60 dias 90 dias p-
valor
F2C
0,260 ± 0,003ª B
0,209 ± 0,005b C
0,214 ± 0,015b B
0,245 ± 0,012a B
0,206 ± 0,003b E
<0,0001
F2Ca
0,335 ± 0,011a A
0,161 ± 0,014c C
0,178 ± 0,012c C
0,214 ± 0,016b BC
0,213 ± 0,002b D
<0,0001
F2B1
0,296 ± 0,040ª AB
0,315 ± 0,024a B
0,230 ± 0,007b B
0,190 ± 0,014c C
0,227 ± 0,001b C
<0,0001
F2B1a
0,314 ± 0,004c AB
0,395 ± 0,003a A
0,210 ± 0,013d B
0,360 ± 0,035b A
0,235 ± 0,001d B
<0,0001
F2B3
0,348 ± 0,052ª A
0,387 ± 0,014a A
0,263 ± 0,006b A
0,238 ± 0,016b B
0,225 ± 0,001b C
<0,0001
F2B3a
0,314 ± 0,030bc AB
0,398 ± 0,060a A
0,252 ± 0,006c A
0,342 ± 0,010ab A
0,298 ± 0,004bc A
<0,002
p-valor
<0,0363
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: F2C: NE com OE de canela (seringa); F2Ca: NE com OE canela (agulha); F2B1: NE com o Blend 1 (seringa); F2B1a: NE
com o Blend 1 (agulha); F2B3: NE com Blend 3 (seringa); F2B3a: NE com Blend 3 (agulha); De acordo com teste de Duncan (p ≤
0.05), diferentes letras maiúsculas entre colunas denotam diferenças significativas entre as amostras (n = 3) e diferentes letras
minúsculas entre linhas denotam diferenças significativas entre os tempos.
68
O espalhamento dinâmico da luz (DLS – Dynamic Light Scattering) utilizado
para determinar o tamanho e a polidispersão das gotículas, é uma técnica não invasiva
para a medição em um sistema de NE. Um laser ilumina as gotículas, o seu
espalhamento é detectado no ângulo determinado, sendo utilizado o de 173° conforme
indicado por Gundel (2020) e Azizkhani (2021). O espalhamento varia de acordo com
o movimento browniano da gotícula que é governado pelo seu tamanho, esse
movimento permite o cálculo do seu tamanho. A diluição da amostra é necessária para
que não ocorram aglomerados de gotículas devido a suas interações, que poderiam
dificultar a leitura das amostras pelo equipamento (BHATTACHARJEE, 2016).
O IPD é uma grandeza adimensional, calculada pelo equipamento, que indica
a distribuição dos tamanhos de partícula na amostra, determina a homogeneidade das
gotículas presentes na NE. Valores próximos a 0,1 são indicativos de monodispersão.
Já valores acima de 0,7 indicam uma distribuição muito heterogênea (polidispersão),
comprometendo a capacidade do equipamento de oferecer uma leitura adequada
(YUAN et al., 2006; MALVERN INSTRUMENTS LTD., 2011; TANG et al., 2012).
Entretanto, a emulsificação é um processo de agitação aleatória e a NE
resultante é dada por um sistema polidisperso onde gotículas grandes e pequenas
coexistem, representando o IPD analisado pelo equipamento, porém, essa
polidispersão deve ser controlada para que não ocorram instabilidades na formulação
ocasionadas pela atuação de famílias de gotículas de tamanhos diferentes
(SALAGER, 2000).
A composição e o método de preparo das NEs são fatores determinantes do
diâmetro médio e da polidispersão das gotículas. Quanto menor for o tamanho de
gotícula maior é a estabilidade, pois o movimento browniano se torna mais significativo
(KONG; PARK, 2011). Por isso, a determinação do tamanho de gotícula é um dos
principais parâmetros de caracterização de NE e avaliação de estabilidade, pois o
tamanho interfere diretamente neste fenômeno.
De acordo com a TABELA 6, é perceptível que as NE obtidas através do
gotejamento direto da fase oleosa com a agulha (1mL/min) apresentaram tamanhos
maiores dos que as obtidas pelo gotejamento da fase oleosa direto da seringa
(1gt/min). Segundo Izadiyan et al. (2017) e Moura et al. (2014), quanto maior for a
agitação e o tempo, maior é o cisalhamento e menor é o tamanho de gotícula,
considerando que o método em que a fase oleosa é adicionada com a agulha, sob
agitação, a quantidade colocada é muito maior por minuto do que a quantidade
69
colocada com a seringa. Desta forma, a fase oleosa fica em uma maior quantidade
presente no meio e o cisalhamento se torna menor sobre ela do que quando a fase
oleosa é colocada com a seringa, onde apenas uma gota da fase é adicionada ao
meio por minuto. Essa pequena quantidade consegue se dispersar em tamanhos
menores do que a adicionada com a agulha, que apresenta NEs com tamanhos de
gotículas maiores.
Os resultados apresentados mostram que em todos os casos, exceto para
F2B3a que manteve seu tamanho, houve uma diminuição do tamanho de gotícula no
intervalo de 1 a 7 dias. Esse comportamento foi visto também no estudo de Dantas e
colaboradores (2021), que sintetizou NE de carvacrol, composto isolado do OE de
orégano.
A discrepância de tamanho das NEs desenvolvidas com o mesmo veículo, se
dá através do tipo de óleo que constitui a fase oleosa, a diferença de densidade dos
OEs presentes e também da porcentagem de seus componentes (COSSETIN et al.,
2021).
De acordo com os resultados, os tamanhos das gotículas permaneceram na
faixa nanométrica após 90 dias de armazenamento em temperatura de 25°C, sem
separação de fases. É visto também que o método utilizado foi eficiente na formação
de gotículas de tamanho nanométrico.
As NE com o OE de canela, F2C e F2Ca, mostraram uma diminuição de
tamanho após 7 dias de desenvolvimento: 106,9 nm para 91,6 nm e 120,6 nm para
100,4 nm, respectivamente. F2C apresentou aumento de tamanho entre 30 (108,1
nm) e 60 dias (151,0 nm) e manteve-se com 150,3 nm até 90 dias após o seu
desenvolvimento. F2Ca demonstrou o mesmo comportamento, embora tenha
continuado a aumentar após 90 dias (114,8 nm; 169,8 nm e 181,7 nm), o mesmo
comportamento foi visto no estudo de Wan et al., (2019), que desenvolveu NE de OE
de canela com Tween 80. Inicialmente a NE de OE canela apresentou tamanho de
91,33 nm e 30 dias depois, armazenada em temperatura de 25°C, a NE apresentou
tamanho de 119,10 nm. Esse aumento pode ser devido ao amadurecimento de
Ostwald e/ou da composição química do OE de canela, pois OEs com compostos mais
hidrossolúveis, como é o caso do eugenol, o principal constituinte do OE de canela,
tendem a promover o crescimento das gotículas da NE através do amadurecimento
de Ostwald (YUKUYAMA et al., 2016; WAN et al., 2019). Entretanto, ao observar o
IPD das NEs com OE de canela é visto que todas ficaram dentro da normalidade
70
quanto a sua distribuição de tamanho de gotículas, não indicando uma instabilidade
como o amadurecimento de Ostwald (RAI et al., 2018), além de não serem observadas
alterações macroscópicas nas formulações.
NE derivadas do blend 1, F2B1 e F2B1a, apresentaram diminuição de
tamanho após 7 dias de 121,8 nm para 103,5 nm e 163,7 nm para 146,1 nm,
respectivamente. Após 30 dias, F2B1 diminuiu (100,6 nm) e F2B1a aumentou (149,4
nm) de tamanho. Entre 60 a 90 dias ambas mostraram mesmo comportamento de
aumento seguido de diminuição, 108,4 nm para 103,0 nm e 168,7 nm para 119,4 nm.
Essa diminuição mantendo um IPD dentro da normalidade, como o ocorrido, é
interessante, pois quanto menor o tamanho de partícula mais estável a NE apresenta-
se, mesmo que a estabilidade não seja determinada apenas pelo tamanho de gotícula
e pelo IPD, ambos tem uma influência significativa (LIANG et al., 2022).
Após 7 dias, F2B3 apresentou diminuição de tamanho de 177,5 nm para 137,2
nm e F2B3a manteve em torno de 230,4 a 229,7 nm com um aumento em seu IPD de
0,314 para 0,398, não sendo considerado uma distribuição heterogênea de gotículas
segundo Mohammed et al. (2020), que consideram um valor de IPD > 0,5 como uma
distribuição heterogênea de tamanho de partículas. F2B3 manteve seu tamanho após
30 dias (135,6 nm), seguido de aumento até o momento da última análise, como o
ocorrido desde os 30 dias para F2B3a, todavia esse aumento de gotículas foi
controlado, sem o acontecimento de polidispersão na formulação em razão dos
valores do IPD destas amostras serem de 0,224 a 0,401 para F2B3 e 0,246 a 0,458
para F2B3a.
Conforme tabela 7, os IPD obtidos mostram que uma distribuição homogênea
de tamanho de gotículas foi alcançada. Essa característica presente nas NE está
relacionada com a metodologia utilizada para o preparo, por meio de Ultraturrax. Liang
(2022), afirma que IPD < 0,4 ainda é um valor aceitável para NEs, enquanto que
Mohammed et al. (2020) considera IPD > 0,5 NEs polidispersas. Baseado nestes
autores, as NEs obtidas não apresentam heterogeneidade. As amostras, não
apresentaram alterações macroscópicas e as gotículas permaneceram dentro da
escala aceitável para serem consideradas como NE, segundo Rai (2018).
71
4.3 POTENCIAL ZETA
O potencial zeta é considerado um dos parâmetros de estabilidade de NEs. É
caracterizado como a diferença de potencial entre a superfície de íons fortemente
ligados à superfície da gotícula e uma região neutra da formulação. Quando o valor
desse potencial é elevado, acima de 30 mV ou de -30 mV em módulo, as forças de
repulsão são suficientes para superar as forças atrativas de Van Der Waals, impedindo
que ocorra a floculação, ou seja, quanto maior o potencial zeta, maior a repulsão
eletroestática entre as gotículas, ocasionando a menor probabilidade de agregação e
instabilidade (FERNANDES, et al., 2020; WEI et al., 2021).
Os resultados obtidos quanto ao potencial zeta das NEs são mostrados na
TABELA 8.
72
TABELA 8 - POTENCIAL ZETA (mV) E DESVIO PADRÃO DAS NANOEMULSÕES
Código
Formulação
1 dia 7 dias 30 dias 60 dias
90 dias
p-
valor
F2C
-24,4 ± 0,60d CD
-30,0 ± 1,70c A
-32,6 ± 0,65b AB
-37,4 ± 0,70a A
-35,2 ± 1,20a A
<0,0001
F2Ca
-22,1 ± 1,91d D
-27,0 ± 1,11c B
-27,3 ± 2,40c C
-30,9 ± 1,15b B
-35,1 ± 0,83a A
<0,0001
F2B1
-26,4 ±1,30bc C
-25,5 ± 0,52c B
-27,9 ± 0,90ab C
-23,2 ± 0,60d C
-28,1 ± 0,30a D
<0,0001
F2B1a
-29,3 ± 0,91a B
-25,9 ± 2,40b B
-29,1 ±1,53a BC
-23,3 ± 0,72b C
-31,0 ± 1,11a C
<0,0005
F2B3
-27,7 ± 2,17a A
-30,0 ± 1,32a A
-33,6 ± 3,72a A
-30,6 ± 1,50a B
-34,7 ± 0,83a A
<0,0668
F2B3a
-24,9 ± 0,75b CD
-32,4 ± 0,94a A
-33,9 ± 1,95a A
-31,7 ± 1,70a B
-32,9 ± 0,46a B
<0,0001
p-valor
<0,0001
<0,0004
<0,0056
<0,0001
<0,0001
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: F2C: NE com OE de canela (seringa); F2Ca: NE com OE canela (agulha); F2B1: NE com o Blend 1 (seringa);
F2B1a: NE com o Blend 1 (agulha); F2B3: NE com Blend 3 (seringa); F2B3a: NE com Blend 3 (agulha); De acordo com
teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras maiúsculas entre colunas denotam diferenças significativas entre as amostras
(n = 3) e diferentes letras minúsculas entre linhas denotam diferenças significativas entre os tempos.
73
O potencial zeta de todas as amostras foi negativo, e isso se dá devido a
utilização de tensoativos não-iônicos na formulação, Tween 80 e Span 80, que estão
associados com a adsorção seletiva de íons hidroxila na interfase óleo-água,
ocasionando a formação de ligações de hidrogênio entre os grupos oxietilenos dos
surfactantes com os íons hidroxila das moléculas de água (MACCELLI et al., 2020).
Estes valores negativos também foram vistos nos estudos de Alam et al. (2017) e
Anwer et al. (2014), que desenvolveram NE de OE de cravo e Tween 80 e no estudo
de Gundel et al. (2020) que desenvolveu formulações de OE de eucalipto e capim-
limão, também utilizando Tween 80 como surfactante.
F2C apresentou potencial zeta inicial de -24,4 mV seguido de aumento do
valor ao longo de 60 dias, onde manteve-se até o fim da análise entre -37,4 mV a -
35,2 mV. F2Ca aumentou após 7 dias, manteve o valor até 30 dias, após 60 e 90 dias
apresentou aumento do valor de -27,3 mV para -30,9 mV até -35,1 mV. Já F2B1 se
manteve com potencial zeta em torno de -27,0 mV, exceto após análise de 60 dias
que apresentou uma diminuição do valor para – 23,2 mV. F2B1a apresentou
oscilações de potencial zeta em torno de -29,0 mV para -23,0 mV e vice-versa. F2B3
não apresentou diferença significativa de valor de potencial zeta ao longo das
análises, mantendo em torno de -30,0 mV. F2B3a apresentou apenas um aumento do
valor após 7 dias de -24,9 mV para – 32,4 mV e manteve esse valor até a última
análise realizada.
O potencial zeta obtido das formulações está de acordo com o encontrado na
literatura para NEs de OEs, como o visto em: Mohammed e colaboradores (2020),
com NE de OE de Nigella sativa; Azizkhani et al. (2021) com NE de OE de estragão
e Lyra (2019) com NE de OE de palmarosa.
Os valores em torno de -20,0 mV obtidos pelas NEs em pelo menos uma das
análises não é significativo de instabilidade das NEs, pois apesar dos valores, as NEs
permaneceram estáveis, com seus outros parâmetros dentro da normalidade, e ainda,
a utilização de surfactantes não iônicos, como é o caso do Tween 80 e do Span 80 na
formulação, estabilizam o sistema, por realizarem um efeito estérico nas gotículas
(FOO et al., 2020; WEI et al., 2021).
Azizkhani e colaboradores (2021), mostraram um estudo em que quanto maior
o potencial zeta negativo das gotículas de NE, maior é a absorção celular dessas
gotículas do que em comparação com gotículas de carga menos negativa ou com
carga superficial positiva. No estudo realizado pelo autor, com NE de OE de estragão
74
ele obteve potencial zeta em torno de -30 mV e essas NEs apresentaram altos efeitos
antimicrobianos, devido a significativa permeação nas células microbianas,
comprovando que valores em torno de -30,0 mV apresentam esses resultados (PATIL
et al., 2007). Portanto, os valores de potencial zeta encontrados corroboram com os
resultados obtidos nas análises microbiológicas realizadas.
4.4 pH
O pH é um parâmetro de caracterização de NEs e também de monitoramento
da estabilidade das formulações, alterações em seu valor indicam reações químicas
presentes ou crescimento microbiano, que podem comprometer a qualidade do
produto final (DANTAS et al., 2021). De acordo com Ozturk et al. (2014), NEs são
consideradas estáveis quando apresentam um pH dentro de uma faixa de 3 a 8.
Os valores de pH obtidos para as formulações após 1, 7, 30, 60 e 90 dias de
preparo são apresentados na TABELA 9.
75
TABELA 9 - pH E DESVIO PADRÃO DAS NANOEMULSÕES
Código
Formulação
1 dia 7 dias 30 dias 60 dias 90 dias p-
valor
F2C
3,23 ± 0,006b B
3,26 ± 0,006a C
3,23 ± 0,011b C
3,22 ± 0,011b B
3,28 ± 0,006a C
<0,0001
F2Ca
3,16 ± 0,006d C
3,20 ± 0,006b D
3,16 ± 0,006c D
3,21 ± 0,006b B
3,30 ± 1,33a B
<0,0001
F2B1
3,13 ± 0,010d D
3,15 ± 0c E
3,18 ± 0b D
3,22 ± 0,017a B
3,21 ± 0,011a D
<0,0001
F2B1a
3,17 ± 0,011b C
3,14 ± 0c E
3,14 ± 0,010c E
3,17 ± 0,006b C
3,18 ± 0,015a E
<0,0022
F2B3
3,30 ± 0,006c A
3,38 ± 0,010a A
3,36 ± 0,015a A
3,31 ± 0bc A
3,33 ± 0,006b A
<0,0001
F2B3a
3,31 ± 0,015a A
3,31 ± 0,011a B
3,32 ± 0,011a B
3,31 ± 0,011a A
3,31 ± 0a AB
<0,6679
p-valor
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: F2C: NE com OE de canela (seringa); F2Ca: NE com OE canela (agulha); F2B1: NE com o Blend 1 (seringa);
F2B1a: NE com o Blend 1 (agulha); F2B3: NE com Blend 3 (seringa); F2B3a: NE com Blend 3 (agulha); De acordo com
teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras maiúsculas entre colunas denotam diferenças significativas entre as amostras
(n = 3) e diferentes letras minúsculas entre linhas denotam diferenças significativas entre os tempos.
76
As NE obtidas apresentaram pH ácido, considerado normal para NEs
formuladas com OE em decorrência da hidrólise dos ésteres de ácidos graxos que
geram ácidos graxos livres, ocasionando a redução do pH (MASMOUDI et al., 2005).
De Campos e colaboradores (2017), em seu estudo de desenvolvimento de NE de
OEs perceberam que quanto maior a concentração de OE presente na formulação,
menor era o pH obtido, e isso justifica os valores baixos de pH obtidos neste estudo,
visto que os OE são 5% da formulação e estão a uma concentração de 50 mg/mL. Os
autores do estudo mencionado utilizaram concentrações de OE individuais a 33
mg/mL e 64 mg/mL e obtiveram pH na faixa de 4,30 a 5,89. Considera-se ainda a
presença de 6 OEs nas formulações das NEs com os blends.
As formulações de Dantas et al. (2021) com carvacrol apresentaram pH ácido
na faixa de 5,60 – 5,94. De Godoi et al. (2017), também obteve pH ácido de suas NEs
com OE de eucalipto, Tween 80 e Span 80, em todas as suas análises de estabilidade
(7, 15, 30, 60, 90 dias após o preparo) com valores em torno de 2,91 a 4,68. Gündel
et al. (2020), alcançou resultados próximos para suas NEs de OE de eucalipto e de
OE de capim-limão, 5,26 e 4,59, respectivamente. Conforme visto, a literatura
corrobora com os resultados encontrados no estudo para pH ácido.
F2B1 é a formulação mais ácida após análise de 1 dia (3,13), manteve-se
ácida 7 dias após desenvolvida, junto com F2B1a (3,15 e 3,14, respectivamente), que
permaneceu até o fim das análises como a amostra de pH mais baixo. Contrariamente,
F2B3 e F2B3a apresentaram um pH ácido mais elevado em todos os tempos de
análise realizados, exceto após 90 dias, que F2Ca apresentou o mesmo valor que
F2B3a.
A partir desses resultados, é possível associar os valores obtidos de potencial
zeta, que é amplamente influenciado pelo pH do meio. A adsorção de íons hidroxila
na interface óleo/água contribui para uma carga superficial negativa, esse baixo valor
de pH justifica maiores valores de potencial zeta, visto que existe essa influência do
pH na carga elétrica dos grupos dos componentes da formulação (COSSETIN et al.,
2021). Os valores de pH mais altos encontrados, apesar de ainda permanecerem
ácidos foram para F2B3, F2B3a e para as NEs de OE de canela. Ao comparar com
os valores de potencial zeta na TABELA 8, nota-se que, exceto pela análise de 1 dia
após desenvolvidas, nas demais, os maiores valores de potencial zeta são para essas
amostras em questão.
77
Considerando a aplicabilidade do produto como um conservante para
cosméticos, que não será utilizado in natura sobre a pele e/ou mucosas e que a sua
quantidade presente no produto final é pequena, seu pH ácido está condizente com o
dos conservantes já disponíveis no mercado como o Microcare® CM, mistura de
isotiazolinonas, com pH na faixa de 3,00 -4,00 (THOR, 2022) e Phenochem NIB,
mistura de parabenos (metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno,
fenoxietanol), com pH na faixa de 3,50 – 4,50 (LABORATORIES SHARON, 2022). A
determinação do pH de produtos cosméticos para pele é de importante avaliação,
visto que qualquer desvio dos valores pode ocasionar irritação na pele, que apresenta
um pH ácido em torno de 4,00 – 6,00. Por isso é interessante que produtos cosméticos
apresentem-se ligeiramente ácidos (BLAAK; STAIB, 2018; PROKSCH, 2018).
4.5 DENSIDADE
A densidade é caracterizada pela relação entre a massa e o volume de uma
substância. Normalmente para líquidos ela é determinada com a utilização de um
picnômetro ou densímetro (ANVISA, 2019).
As NE desenvolvidas apresentam 91% de água, 2% de Tween 80, 2% de
Span 80 e 5% de OE (Blend 1 ou Blend 3 ou OE de canela) em sua composição.
Água, Tween 80 e Span 80 apresentam densidades de 1,0000 g/mL, 1,0600 g/mL,
0,9860 g/mL, respectivamente (MERCK, 2022) O Blend 1, blend 3 e o OE de canela
apresentam densidades de 0,9479 g/mL, 0,9597 g/mL e 1,030 g/mL, respectivamente.
78
TABELA 10 - DENSIDADE E DESVIO PADRÃO DAS NANOEMULSÕES
Código
Formulação
1 dia 7 dias 30 dias 60 dias 90 dias p-
valor
F2C
0,9973 ± 0,0100a A
0,9972 ± 0,0002a A
0,9964 ± 0,0001b B
0,9963 ± 0,0001bc B
0,9960 ± 0,0002c B
<0,0001
F2Ca
0,9937 ± 0,0002d E
0,9953 ± 0c C
0,9979 ± 0,0002b A
0,9980 ± 0,0001a A
0,9988 ± 0,0003a A
<0,0001
F2B1
0,9964 ± 0,0001a B
0,9963 ± 0ab B
0,9957 ± 0,0001d C
0,9960 ± 0,0001bc C
0,9957 ± 0,0003cd B
<0,0006
F2B1a
0,9955 ± 0,0001ab D
0,9952 ± 0,0001b C
0,9954 ± 0ab D
0,9956 ± 0,0001a D
0,9956 ± 0,0003a B
< 0,0428
F2B3
0,9961 ± 0,0001a C
0,9955 ± 0,0001b C
0,9952 ± 0,0001b D
0,9952 ± 0,0001b E
0,9955 ± 0,0002b B
<0,0002
F2B3a
0,9958 ± 0,0001c D
0,9962 ± 0,0002ab B
0,9963 ± 0a B
0,9962 ± 0,0001ab BC
0,9959 ± 0,0001bc B
<0,0098
p-valor
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: F2C: NE com OE de canela (seringa); F2Ca: NE com OE canela (agulha); F2B1: NE com o Blend 1 (seringa); F2B1a: NE com o
Blend 1 (agulha); F2B3: NE com Blend 3 (seringa); F2B3a: NE com Blend 3 (agulha); De acordo com teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras
maiúsculas entre colunas denotam diferenças significativas entre as amostras (n = 3) e diferentes letras minúsculas entre linhas denotam
diferenças significativas entre os tempos.
79
Conforme a TABELA 10, todos os valores ficaram próximos 1,0000 g/mL,
sendo semelhantes a densidade do seu composto majoritário, a água. Esses
resultados são compatíveis aos encontrados na literatura para NE de OEs, como é o
caso da faixa de densidade de 1,005 – 1,020 g/mL para NEs de OE de canela, OE de
alecrim e OE de orégano (DÁVILA-RODRÍGUEZ et al., 2019). Nirmal e colaboradores
(2018), apresentaram resultados de densidades de 1,006, 1,004 e 1,009 g/mL para
suas NE de OE de murta-limão e murta-anis, essas NEs também foram desenvolvidas
com Span 80, Tween 80 e água, conforme a deste estudo.
4.6 MORFOLOGIA
A caracterização das formulações nanoestruturadas por técnicas de
microscopia eletrônica é essencial para a obtenção de dados confiáveis sobre a
morfologia do sistema desenvolvido. Desta forma, esta análise é indispensável para a
avaliação das gotículas formadas em NEs. A análise morfológica permite identificar o
tamanho, forma e estrutura interna, além de possibilitar observar possíveis agregados
que passam despercebidos em uma análise de tamanho por DLS, por exemplo
(KLANG et al., 2012).
Na microscopia eletrônica de varredura (MEV) um feixe de elétrons focalizado
passa pela amostra realizando uma “varredura” sendo vários sinais gerados e
coletados para a formação de uma imagem. Essa microscopia, diferente da
microscopia eletrônica de transmissão (MET), avalia a topografia e apresenta grande
profundidade de foco, além de disponibilizar uma imagem 2D (DIVSALAR et al., 2012;
KLANG et al., 2012).
A MEV foi realizada para as seguintes amostras: F2B1 e F2B3 após 60 dias
de desenvolvimento e F2B1, F2B1a, F2B3 e F2B3a após 150 dias de
desenvolvimento. Infelizmente não foi possível realizar a análise para todas as
amostras desenvolvidas e nem realizar a determinação do tamanho médio de gotícula
por questões laboratoriais.
Ao observar as FIGURAS 16, 17, 18, 19, 20 e 21 nota-se claramente a
presença de gotículas lisas com algumas irregularidades e esféricas/arredondadas
em sua maioria, a porção em tom de cinza mais escuro ao redor de algumas gotículas
é o OE presente, que extravasou em decorrência da alta pressão exercida pelo
método de análise.
80
Nas FIGURAS 19 (B e C), e 21 (A), percebe-se artefatos nas gotículas e ao
fundo das imagens, que veio a ocorrer durante o preparo das amostras para a análise,
podendo ser da etapa de secagem da amostra ou da metalização com ouro realizada
sobre a amostra. A presença de gotículas mais aglomeradas como o visto nas
FIGURAS 18 (A e B2) e em 20 (A) e a aparência das gotículas vistas nas FIGURAS
16, 17, 18, 19, 20 e 21 (A), como gotículas secas, se dá devido ao método de preparo
da amostra que consiste na evaporação da água (FERNANDEZ et al., 2004).
As imagens também mostram que após 60 e 150 dias de desenvolvimento,
as NE ainda apresentam gotículas esféricas após seu armazenamento a longo prazo,
indicando que as formulações não apresentaram problemas de estabilidade até o
período em que a análise foi realizada, o que corrobora com a aparência macroscópica
e com os outros resultados de caracterização.
Sedaghat Doost e colaboradores (2019) apresentaram resultados
semelhantes de MEV para suas NE de timol, um dos componentes majoritários do
OEs de tomilho e de orégano. A análise foi realizada após 30 dias de armazenamento
e suas gotículas permaneceram esféricas.
A superfície externa das gotículas quando observadas nas maiores
magnificações mostra-se como lisa e quase regular e essa característica advém do
Tween 80 que forma este filme continuo que envolve as gotículas de OE
(SUNDARARAJAN et al., 2018).
FIGURA 16 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B1 APÓS 60 DIAS DE DESENVOLVIMENTO
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Magnitude de 1.00kx; B) Magnitude de 15.0 kx; C) Magnitude de 30.0 kx.
81
FIGURA 17 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B1 APÓS 150 DIAS DE DESENVOLVIMENTO
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Magnitude de 1.00kx; B) Magnitude de 15.0 kx; C) Magnitude de 30.0 kx.
FIGURA 18 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B1a APÓS 150 DIAS DE DESENVOLVIMENTO
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Magnitude de 1.00kx; B1 e B2) Magnitude de 15.0 kx.
FIGURA 19 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B3 APÓS 60 DIAS DE DESENVOLVIMENTO
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Magnitude de 1.00kx; B) Magnitude de 15.0 kx; C) Magnitude de 30.0 kx.
82
FIGURA 20 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B3 APÓS 150 DIAS DE DESENVOLVIMENTO
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Magnitude de 1.00kx; B) Magnitude de 15.0 kx; C) Magnitude de 30.0 kx.
FIGURA 21 - IMAGENS DO MEV PARA NE F2B3a APÓS 150 DIAS DE DESENVOLVIMENTO
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Magnitude de 1.00kx; B) Magnitude de 15.0 kx; C) Magnitude de 30.0 kx.
4.7 CONSIDERAÇÕES DOS PARÂMETROS DE CARACTERIZAÇÃO
Todos os parâmetros caracterizados das NEs desenvolvidas estão
correlacionados entre si.
Considerando o desenvolvimento de um conservante para formulações
cosméticas, Fardous e colaboradores (2021), mencionam que gotículas com tamanho
< 250 nm não podem penetrar sob a pele pelas junções apertadas das células
endoteliais de tecidos saudáveis, devido ao seu grande tamanho. Isso corrobora com
a o estabelecido no regulamento (CE) n.º 1223/2009 do parlamento europeu e do
conselho que classifica nanomaterias como um material insolúvel ou biopersistente
fabricado intencionalmente com uma ou mais dimensões externas ou uma estrutura
interna, na escala de 1 a 100 nm. As nanoemulsões desenvolvidas apresentaram-se
83
solúveis, não biopersistentes e com estruturas de dimensões maiores do que 100 nm,
portanto, são aptas para a aplicação em cosméticos. inclusive F2B3a apresenta
tamanho < 250 nm.
4.8 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Para avaliação da atividade antimicrobiana, foi utilizado o método de
microdiluição em caldo. É um dos mais utilizados para esta finalidade , por ser mais
eficiente, permitir a realização de várias réplicas do experimento e também, mais
barato, por utilizar poucos volumes de reagentes e materiais (VEIGA et al., 2019). É o
mais adequado para determinação de CIM, por oferecer a possibilidade de estimar a
concentração do agente antimicrobiano testado no caldo de cultivo (CHOUHAN;
SHARMA; GULERIA, 2017). Como indicativo de crescimento microbiano, foi utilizado
o cloreto de 2, 3, 5-trifeniltetrazólio (TTC), que inicialmente é incolor, é quando
reduzido pelo metabolismo dos micro-organismos, tornando-se um formazano de
coloração rósea a avermelhada (FROST et al., 2016). A redução do TTC é evidente
para as bactérias e não ocorre ou é sutil para a levedura, neste caso avalia-se pela
turvação do meio e não pela coloração rósea/avermelhada (VEIGA, et al., 2019).
Para a avaliação da atividade antimicrobiana do OE de canela foi utilizada a
concentração de 2,0 μL/mL para as bactérias e 4,0 μL/mL para a levedura C. albicans
no primeiro poço, pois Fedérle (2018), realizou uma triagem para determinação da
concentração inibitória mínima (CIM) de OEs, inclusive do OE de canela, indicando
que essa concentração inicial seria a indicada para o presente estudo.
O motivo deste ensaio foi avaliar se a acomodação dos OEs em um sistema
nanoestruturado, influenciaria a atividade antimicrobiana já comprovada ou não, e se
o OE continuaria apresentando atividade antimicrobiana. Considerando a aplicação
das NEs como sistemas conservantes de cosméticos, essa atividade deve ser
mantida.
84
FIGURA 22 - ATIVIDADE ANTIMICROBIANA EM MICROPLACAS: OE DE CANELA, F2C E F2Ca
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: 1) E. coli; 2) C. albicans; 3) P. aeruginosa; 4) S. aureus. CP: Controle Positivo; CN:
Controle negativo; BCN: Branco do controle negativo; BOEC: Branco do OE de canela; BF2C:
Branco da NE F2C; BF2Ca: Branco da NE F2Ca; OEc: Óleo essencial de canela; MP:
Metilparabeno; CTween80: Controle Tween 80; CSpan80: Controle Span 80.
Na FIGURA 22, observam-se os resultados para OE de canela puro e das
suas respectivas NEs, F2C e F2Ca, avaliadas em 30 dias após o seu
desenvolvimento. O OE de canela e a NE F2C apresentaram a mesma CIM para todas
as bactérias em teste sendo 0,5 μL/mL que corresponde a 5,15 mg/mL de OE puro e
de 1,6 mg/mL, respectivamente. Para E. coli (1) e S. aureus (4), F2Ca apresentou CIM
de 3,125 mg/mL. Para P. aeruginosa (3) e E. coli (1), o metilparabeno (MP)
apresentou CIM de 2 μg/mL. Para a levedura C. albicans (2), a CIM do OE de canela
foi de 0,0625 μL/mL (0,644 mg/mL de OE puro), F2C e F2Ca, inibiram todo o
crescimento da levedura, mostrando que essas NEs são mais potentes para a
levedura do que para as bactérias. O MP apresentou CIM de 0,125 μg/mL. O resultado
obtido de F2Ca para P. aeruginosa foi de 1,6 mg/mL. Para o S. aureus o MP
apresentou CIM de 4,0 μg/mL. Os controles do Span 80 e do Tween 80, conforme o
previsto, apresentaram crescimento do micro-organismo, mostrando que não são eles
que realizam a atividade antimicrobiana e sim o OE de canela presente nas NEs. O
85
controle positivo (CP) e controle negativo (CN) também apresentaram resultados
esperados de inibição e crescimento, respectivamente.
Segundo Zhang e colaboradores (2015), o mecanismo de ação do OE de
canela está baseado na perda de eletrólitos dos micro-organismos ocasionados pelo
aldeído cinâmico.
É notável que a atividade antimicrobiana das NEs de OE de canela é superior
ao OE de canela puro. O mesmo foi visto nos resultados de Liang (2022), que
desenvolveu NEs com OE de canela. e em suas análises microbiológicas para 6
micro-organismos incluindo E. coli, P. aeruginosa e S. aureus, NEs apresentaram
maior potência frente aos micro-organismo do que o OE de canela puro. Outros
resultados observados foram uma melhora na biodisponibilidade e estabilidade do OE
de canela e as microscopias eletrônicas de varredura e transmissão mostraram que
as NEs destruíram a estrutura das bactérias.
F2C apresentou tamanho de gotícula menor do que F2Ca, e essa diferença
de tamanho pode ter ocasionado a maior potência de F2C para E. coli e S. aureus.
Estudos mostram que quanto menor o tamanho de gotícula maior é a atividade
antimicrobiana devido a facilidade de penetração pela membrana do micro-organismo
(ANWER et al., 2014; FALLEH et al., 2021).
NEs apresentam maior estabilidade cinética, desta forma protegem OE contra
a degradação e evaporação, além de apresentarem acessibilidade biológica, devido
ao aumento da área de superfície, que facilita a migração de gotículas de tamanho
nanométrico através da membrana celular de micro-organismos (FATTAHI et al.,
2020).
O estudo de Wan e colaboradores (2019), mostrou que em suas NEs de OEs
individualizadas de cravo, capim-limão, tomilho, hortelã-pimenta e canela os principais
componentes químicos presentes nos OEs tiveram melhoria notável na estabilidade
física a longo prazo, na atividade antifúngica e inibição da produção de micotoxinas
que foi aumentada quando submetidos às NEs, devido a maior solubilidade dos OEs
nesse sistema nanoestruturado.
As FIGURAS 23, 24, 25 e 26 apresentam recortes das placas dos ensaios
antimicrobianos realizados para os Blends 1 e 3 e suas respectivas NEs (F2B1,
F2B1a, F2B3 e F2B3a) nos tempos de 30 e 90 dias após desenvolvimento. As placas
foram desenvolvidas conforme a FIGURA 22, apenas as amostras foram trocadas. Os
blends foram colocados puros na fileira A, assim como as NEs, entretanto no primeiro
86
poço elas apresentam concentração de 25 mg/mL considerando o blend de OEs
presente na amostra.
Como os blends 1 e 3 foram testados puros, houve a inibição de crescimento
de todos os micro-organismos submetidos ao experimento.
Para a E. coli, um bacilo Gram-negativo, fermentador, F2B1 apresentou CIM
de 0,40 mg/mL aos 30 e aos 90 dias e F2B1a de 0,80 mg/mL nos dois tempos
analisados. F2B3a com CIM de 0,40 mg/mL após 30 dias de desenvolvimento e 0,80
mg/mL após 90 dias.
Para a P. aeruginosa, formato bacilar e Gram-negativa, todas as amostras
apresentaram CIM < 0,20 mg/mL.
Para S. aureus, F2B1a apresentou CIM de 0,80 mg/mL e 0,40 mg/mL após 30
e 90 dias, respectivamente. F2B3a exibiu CIM de 0,40 mg/mL para ambos os tempos
testados.
Micro-organismos Gram-negativos apresentam porinas na composição de sua
membrana externa, que é rígida e rica em lipopolissacarídeo (LPS) que limita a difusão
de compostos hidrofóbicos. Esses “poros” permitem o influxo de partículas hidrofílicas
e atuam como uma barreira para compostos lipofílicos, como os OEs e para partículas
de tamanho não compatíveis para entrada por essas estruturas. Neste caso NEs são
perfeitas candidatas de atuação nestes micro-organismos, pois apresentam tamanho
reduzido, podendo entrar pelas porinas, carregando os OEs que apresentam atividade
antimicrobiana e devido a sua formulação apresentam hidrofilia, possibilitando a
interação com as porinas (FALLEH et al., 2021). Já bactérias Gram-positivas são mais
suscetíveis aos OEs, e facilitam a sua difusão para o interior da célula, devido a suas
extremidades lipofílicas do ácido lipoteicóico presente em sua membrana celular
(CHOUHAN; SHARMA; GULERIA, 2017).
Para a levedura, C. albicans, apenas F2B3a apresentou CIM sendo a de 0,40
mg/mL em ambos os tempos após desenvolvimento da amostra. Essa excelente
atividade antifúngica das NEs para a levedura é conferida pela alta capacidade de
difusão através da membrana das células eucarióticas dos fungos, seguido de ruptura,
o que resulta em uma inibição eficaz desse micro-organismo, além de liberar os OEs
mais rapidamente devido ao seu menor tamanho e apresentar melhor solubilidade
(JACUMAZO et al., 2020).
As NEs atuam aproximando as pequenas gotículas com OEs da membrana
celular, melhorando a acessibilidade e permitindo o rompimento, alterando a
87
integridade da bicamada fosfolipídica ou interferindo com proteínas de transporte
como é caso das porinas (MOGHIMI et al., 2016).
Os resultados mostraram que as NEs dos blends foram efetivas para os micro-
organismos testados, mostrando que os OEs continuam desempenhando sua função
de atividade antimicrobiana. É visto que para os Blends, assim como para o OE de
canela, NEs de menores tamanhos, como é o caso de F2B1 e F2B3, apresentaram
maior potencial de atividade antimicrobiana para os micro-organismos testados, do
que as NEs que apresentam tamanho superior, que é o caso de F2B1a e F2B3a.
FIGURA 23 - ENSAIO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS BLENDS 1 E 3 E
SUAS RESPECTIVAS NANOEMULSÕES PARA E. coli
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Amostras Blend 1, F2B1 e F2B1a após
30 dias; B) Amostras Blend 1, F2B1 e F2B1a após 90
dias; C) Amostras Blend 3, F2B3 e F2B3a após 30 dias
e D) Amostras Blend 3, F2B3 e F2B3a após 90 dias.
88
FIGURA 24 - ENSAIO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS BLENDS 1 E 3 E
SUAS RESPECTIVAS NANOEMULSÕES PARA P. aeruginosa
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Amostras Blend 1, F2B1 e F2B1a
após 30 dias; B) Amostras Blend 1, F2B1 e F2B1a
após 90 dias; C) Amostras Blend 3, F2B3 e F2B3a
após 30 dias e D) Amostras Blend 3, F2B3 e
F2B3a após 90 dias.
FIGURA 25 - ENSAIO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS BLENDS 1 E 3 E
SUAS RESPECTIVAS NANOEMULSÕES PARA S. aureus
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Amostras Blend 1, F2B1 e
F2B1a após 30 dias; B) Amostras Blend 1,
F2B1 e F2B1a após 90 dias; C) Amostras
Blend 3, F2B3 e F2B3a após 30 dias e D)
Amostras Blend 3, F2B3 e F2B3a após 90
dias.
89
FIGURA 26 - ENSAIO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS BLENDS 1 E 3 E
SUAS RESPECTIVAS NANOEMULSÕES PARA C. albicans
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Amostras Blend 1, F2B1 e F2B1a
após 30 dias; B) Amostras Blend 1, F2B1 e F2B1a
após 90 dias; C) Amostras Blend 3, F2B3 e F2B3a
após 30 dias e D) Amostras Blend 3, F2B3 e
F2B3a após 90 dias.
Os resultados de CIM e CL50% encontrados para os blends (1 e 3) por
Fedérle (2018), são mostrados na TABELA 11, junto com os resultados de CIM obtidos
das NEs desenvolvidas neste estudo para realizar a comparação com os valores
encontrados para os blends. Para determinar os valores de faixa de CIM encontrados
por Fedérle (2018) em mg/mL foram consideradas as densidades de cada blend
sendo de 0,9479 g/mL para o blend 1 e 0,9597 g/mL para blend 3. Para as amostras
de NEs em que não foi determinada a CIM por terem inibido todo o crescimento do
micro-organismo, foi considerado como CIM o valor de < 0,20 mg/mL, por ser a menor
concentração testada em que não houve crescimento microbiano.
90
TABELA 11 - TABELA COMPARATIVA DA CIM DOS BLENDS 1 E 3 PUROS COM AS SUAS RESPECTIVAS NEs
REFERÊNCIA
DADOS Fedérle (2018)
DADOS DO ESTUDO (mg/mL)
MICRO
-
ORGANISMO
BLEND
CL
50% (μ
L/mL) ±
DP
FAIXA CIM
ENCONTRADA
(mg/mL)
CIM F2B1 /
CIM F2B3
30 dias
CIM F2B1 /
CIM F2B3
90 dias
CIM F2B1a /
CIM F2B3a
30 dias
CIM F2B1a /
CIM F2B3a
90 dias
S. aureus
B1
0,20±0,06
0,27 – 0,49
<0,20
<0,20
0,80
0,40
B3
0,09±0,02
0,13 – 0,21
<0,20
<0,20
0,40
0,40
E. coli
B1
0,36±0,15
0,40 – 0,97
0,40
0,40
0,80
0,80
B3
0,27±0,04
0,44 – 0,60
<0,20
<0,20
0,40
0,80
P. aeruginosa
B1
0,85±0,08
1,46 – 1,76
<0,20
<0,20
<0,20
<0,20
B3
0,39±0,03
0,69 – 0,81
<0,20
<0,20
<0,20
<0,20
C. albicans
B1
0,13±0,01
0,23 – 0,27
<0,20
<0,20
<0,20
<0,20
B3
0,10±0,02
0,15 – 0,23
<0,20
<0,20
0,40
0,40
FONTE: Adaptado de FEDÉRLE (2018); A autora (2022).
91
Considerando a tabela acima, para S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans,
F2B1 foi mais potente do que o blend 1, pois a CIM da faixa encontrada por Fedérle
(2018) é superior a encontrada neste estudo. F2B1a foi mais potente que o Blend 1
para a P. aeruginosa e C. albicans. F2B3 apresentou maior potencial antimicrobiano
para E. coli e P. aeruginosa do que o blend 3. E, F2B3a demonstrou maior potencial
antimicrobiano apenas para P. aeruginosa do que o blend 3 puro.
De acordo com os resultados, deve-se considerar os fatores que determinam a
atividade antimicrobiana dos OEs, como composição, grupos funcionais presentes em
seus componentes ativos e também as suas interações sinérgicas (AZHDARZADEH;
HOJJATI, 2016), como é o caso dos blends, estes são compostos por 6 OEs que
atuam de forma sinérgica contra os micro-organismos. Além de que, o mecanismo de
ação antimicrobiano varia com o tipo e quantidade de OE presente e contra qual cepa
do micro-organismo ele está atuando (CHOUHAN; SHARMA; GULERIA, 2017). O
estudo de Guerra-rosas e colaboradores (2017), corrobora para os resultados em que
o blend apresenta maior CIM do que as NEs, nos seus estudos foi encontrado que a
atividade antimicrobiana das NEs está fortemente relacionada com o tipo de OE e não
é tão influenciada pelo tamanho das gotículas.
Na literatura não foram encontrados NEs semelhantes as desenvolvidas,
entretanto, Zhang e colaboradores (2017), preparou NEs de OE de cravo e de canela
usando Tween 80 e etanol e mesmo em concentrações muito baixas as NEs
apresentam maior atividade antimicrobiana contra E. coli, B. subtilis, S. typhimurium e
S. aureus, mostrando que NEs de blends de OEs tem potencial de ser um agente
antimicrobiano natural.
Contudo, a combinação de vários OEs com diferentes propriedades
antimicrobianas e diferentes composições, pode aumentar muito a atividade
antimicrobiana, pela junção de vários mecanismos diferentes contra os micro-
organismos, sendo a melhor estratégia de controle até mesmo de patógenos
multirresistentes (DONSÌ et al., 2012; ZHANG et al., 2017).
4.9 TESTE DO DESAFIO CONSERVANTE (CHALLENGE TEST)
Especificações microbiológicas de matérias-primas e produtos cosméticos
acabados e os resultados de teste desafio (Challenge Test) são elementos
92
obrigatórios para a produção, comercialização e comprovação da estabilidade de
produtos cosméticos (GUIA ABC MICROBIOLOGIA, 2017).
As contaminações em produtos cosméticos ocasionam alterações
organolépticas no produto, como mudanças de odor, cor, consistência e
instabilidades, como separação de fases, diminuição dos efeitos prometidos e
problemas aos consumidores como alergias e irritações (HALLA et al., 2018).
Entretanto, o uso excessivo de conservantes nos produtos cosméticos tem
ocasionado um aumento significativo de alergias nas últimas décadas, o que acarretou
no aumento da conscientização do consumidor em relação aos preservantes
utilizados, sendo os naturais os preferidos (KOČEVAR GLAVAČ; LUNDER, 2018).
O teste do desafio do poder conservante consiste em uma contaminação
proposital do produto com micro-organismos específicos e avaliação da carga de
sobreviventes em intervalos de tempos definidos. Auxilia também na avaliação do
sistema conservante de produtos que tenham passado por estresse microbiano por
uma falha de processo de fabricação, fornecendo resultados que garantem se o
produto realmente terá o prazo de validade respeitado. É avaliada também a
concentração ideal de conservante possível para aquele produto ser considerado
seguro para o consumidor, tanto em aspectos microbiológicos como em questões de
toxicidade (GUIA ABC MICROBIOLOGIA, 2017; ALMOUGHRABIE et al., 2020).
As TABELAS 12 e 13 apresentam os resultados obtidos no Challenge Test
para as amostras: Com conservante (Phenochem NIB), sem conservante, F2B1 e
F2B3 a 1% (10,0 mg de cada Blend), considerando os inóculos de pool de bactérias
(E. coli, P. aeruginosa, S. aureus) e pool de fungos (C. albicans e A. brasiliensis).
De acordo com a Farmacopeia Brasileira, 6ª ed. (2019), a emulsão
desenvolvida no estudo se encaixa como produto da categoria 2, que corresponde a
“produtos de uso tópico, constituídos de base, ou veículo aquoso, produtos nasais não
estéreis e emulsões, incluindo aqueles aplicados em membranas mucosas”. Ao 14°
dia bactérias devem apresentar redução de 2 logs do nº de UFC inicialmente inoculado
e quanto a bolor e levedura, não deve ter aumento do nº de UFC inicialmente
inoculado. Ao 28º dia não deve haver aumento da contagem em relação ao 14º dia
para as bactérias e não deve haver aumento do nº de UFC inicialmente inoculado para
o bolor e levedura.
93
TABELA 12 - RESULTADOS CHALLENGE TEST PARA POOL DE BACTÉRIAS
AMOSTRA
Inóculo
T0
T7
T14
T28
UFC/mL
Log
UFC/mL
Log
UFC/mL
Log
UFC/mL
Log
UFC/mL
Log
Sem conservante
3,0x105
5,48
5,0x105
5,70
6,0x105
5,78
6,5x105
5,81
7,0x105
5,85
Com conservante
3,0x105
5,48
2,5x104
4,40
<10
-
<10
-
<10
-
F2B1 (1%)
3,0x105
5,48
5,5x104
4,74
1,5x103
3,18
<10
-
<10
-
F2B3 (1%)
3,0x105
5,48
4,5x104
4,65
2,5x103
3,40
<10
-
<10
-
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: T0) Tempo 0; T7) Tempo de 7 dias; T14) Tempo de 14 dias; T28) Tempo de 28 dias.
TABELA 13 - RESULTADOS CHALLENGE TEST PARA POOL DE FUNGOS
AMOSTRA
Inóculo
T0
T7
T14
T28
UFC/mL
Log
UFC/mL
Log
UFC/mL
Log
UFC/mL
Log
UFC/mL
Log
Sem conservante
3,0x105
5,48
4,5x105
5,65
5,4x105
5,73
5,8x105
5,76
6,3x105
5,80
Com conservante
3,0x105
5,48
1,5x104
4,18
<10
-
<10
-
<10
-
F2B1 (1%)
3,0x105
5,48
1,0x104
4,00
2,5x103
3,40
<10
-
<10
-
F2B3 (1%)
3,0x105
5,48
2,5x104
4,40
3,0x103
3,48
<10
-
<10
-
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: T0) Tempo 0; T7) Tempo de 7 dias; T14) Tempo de 14 dias; T28) Tempo de 28 dias.
94
Os resultados expressos nas TABELAS 12 e 13, mostram que para as duas
NEs desenvolvidas (F2B1 e F2B3), à 1%, a contagem de micro-organismos ao 14° dia
foi praticamente zerada tanto na amostra inoculada com o pool de bactérias quanto
na inoculada com o pool de fungos, mostrando que as NEs atuaram efetivamente
como sistemas conservantes desta emulsão.
Segundo Alves (2018), o método descrito nas diretrizes do CTFA (Cosmetics,
Toiletries and Perfume Agency), atualmente conhecido como Personal Care, Products
Concil (PCPC), recomenda a utilização de culturas puras ou mistas, assim como o
Guia ABC microbiologia (2017), neste estudo as culturas mistas foram utilizadas
(pools) por mimetizarem um perfil mais real de contaminação. A mesma diretriz ainda
recomenda uma segunda inoculação para avaliar como o conservante se comportará
a múltiplas contaminações, o que também foi realizado neste estudo no tempo de 7
dias, indicando que as NEs conseguiram assegurar a formulação após uma segunda
inoculação.
4.10 ESTABILIDADE DE EMULSÃO COM NES DE BLENDS DE OEs
4.10.1 Parâmetros organolépticos e físico-químico
A FIGURA 27, apresenta as amostras: Com conservante, com 0,3%, 0,5%,
1%, 2% e 2,5% de F2B1 e F2B3, aos 90 dias após seu desenvolvimento. Foram
avaliadas nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, dispostas em temperatura ambiente (25 ±
2°C).
Os resultados, segundo aos parâmetros avaliados, indicaram que as
emulsões permaneceram com seus parâmetros organolépticos estáveis até a última
avaliação aos 90 dias. A cor permaneceu branca para todas as amostras. Para as
amostras com F2B1 o odor identificado era o do Blend 1, para as amostras com F2B3
do Blend 3 e a amostra com conservante apresentou odor de “base cosmética”.
Quanto ao aspecto, as amostras permaneceram conforme o esperado, brilhosas, sem
precipitação ou separação de fases. A sensação ao tato permaneceu ao longo dos
meses, com boa espalhabilidade, sem a presença de grânulos ou outros
inconvenientes de formulação.
95
Quanto ao aspecto físico-químico avaliado, pH, os resultados são mostrados
na TABELA 14. A única amostra que não apresentou diferença significativa de pH nos
diferentes tempos foi a emulsão com 2% de F2B3 as demais apresentaram pequenas
alterações significativas entre os tempos avaliados.
FIGURA 27 - EMULSÕES FOTOGRAFADAS AOS 90 DIAS APÓS O SEU
DESENVOLVIMENTO
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: A) Com conservante; B) F2B1 0,3%; C) F2B3 0,3%; D) F2B1
0,5%; E) F2B3 0,5%; F) F2B1 1%; G) F2B3 1%; H) F2B1 2%; I) F2B3 2%;
J) F2B1 2,5% e K) F2B3 2,5%.
96
TABELA 14 - pH E DESVIO PADRÃO DAS EMULSÕES
Emulsão
T0
T30
T60
T90
p-valor
Sem conservante
6,18 ± 0,006
-
-
-
-
Com conservante
6,24 ± 0,006b F
6,26 ± 0,006a D
6,24 ± 0,006b G
6,26 ± 0,006a E
<0,0060
0,3% F2B1
6,41 ± 0,010c A
6,44 ± 0,006b A
6,45 ± 0,006b A
6,47 ± 0,006a A
<0,0001
0,3% F2B3
6,06 ± 0,020ab I
6,04 ± 0,010b G
6,07 ± 0,006a K
6,07 ± 0,006a I
<0,0424
0,5% F2B1
6,38 ± 0,006c B
6,42 ± 0,006a B
6,41 ± 0,006ab B
6,40 ± 0b B
<0,0002
0,5% F2B3
6,14 ± 0,006c H
6,13 ± 0d F
6,17 ± 0a J
6,15 ± 0,006b H
<0,0001
1% F2B1
6,36 ± 0,006a C
6,34 ± 0,006b C
6,32 ± 0c D
6,34 ± 0,006b C
<0,0001
1% F2B3
6,21 ± 0,006a G
6,20 ± 0,006a E
6,18 ± 0,006b I
6,20 ± 0a G
<0,0028
2% F2B1
6,30 ± 0c D
6,33 ± 0b C
6,35 ± 0,006a C
6,34 ± 0,006a C
<0,0001
2% F2B3
6,26 ± 0,006a E
6,26 ± 0,006a D
6,26 ± 0,006a F
6,27 ± 0,006a D
<0,0520
2,5% F2B1
6,27 ± 0,006ab E
6,26 ± 0,006c D
6,28 ± 0,006a E
6,27 ± 0,006bc D
<0,002
2,5% F2B3
6,23 ± 0a F
6,20 ± 0,006c E
6,20 ± 0,006c H
6,22 ± 0b F
<0,0001
p-valor
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: T0: Tempo 0, T30: tempo de 30 dias; T60: tempo de 60 dias e T90: tempo de 90 dias; De acordo com
teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras maiúsculas entre colunas denotam diferenças significativas entre as
amostras (n = 3) e diferentes letras minúsculas entre linhas denotam diferenças significativas entre os tempos.
97
Baseado na avaliação organoléptica e no parâmetro microbiológico obtido ,
essa pequena alteração de pH apresentada entre as amostras nos diferentes tempos,
não indicou instabilidade do sistema e todas as amostras apresentaram pH compatível
com o de emulsões para pele, que devem apresentar um pH levemente ácido ou
neutro, sem ultrapassar pH 7,50, visto que a pele apresenta um pH entre 4,50 – 6,00
(GOMES, DAMAZIO, 2009; BONTORIM, 2009; MOJUMDAR; SPARR, 2021).
4.10.2 Parâmetro microbiológico (contagem microbiana)
Realizada a fim de avaliar a integridade microbiológica das emulsões
desenvolvidas com as NEs dos blends de OE atuando como conservante.
A resolução 481 de 1999 (RES 481/1999) da ANVISA, determina os limites
microbiológicos recomendados para os produtos de higiene pessoal, cosméticos e
perfumes que considera dois aspectos: quanto a segurança para os consumidores e
quanto a tolerância quantitativa da carga microbiana saprofítica presente nos
produtos. Os limites determinados na resolução são divididos em 2 subgrupos: I)
produtos para uso infantil, área dos olhos e os que entram em contato com mucosas;
II) Demais produtos cosméticos susceptíveis a contaminação microbiológica
A emulsão desenvolvida é com finalidade corporal, portanto se enquadra no
tipo II, onde a contagem de micro-organismos mesófilos totais aeróbios não pode ser
maior do que 5x103 UFC/g, deve apresentar ausência de Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus e coliformes totais e fecais em 1g de produto (ANVISA, 2022).
Apenas a contagem de micro-organismos nos tempos de 30, 60 e 90 dias
após seu desenvolvimento foi realizada, não sendo feita metodologias de pesquisa de
patógenos com ágar Mac Conkey para coliformes totais e fecais e testes
confirmatórios como ágar Cetrimide para P. aeruginosa e ágar Vogel-Johnson para S.
aureus (GUIA ABC MICROBIOLOGIA, 2017).
A avaliação microbiológica de cosméticos é necessária para evitar infecções
tópicas devido a contaminação microbiana, podendo levar a mudanças físico-
químicas e organolépticas no produto (RATAJCZAK et al., 2015). A contaminação
microbiana pode ser de fontes diretas como embalagens, matéria-prima, água
utilizada para a fabricação, ou indiretas, de pessoas, equipamentos e do ambiente.
98
Dessa forma, a carga microbiana presente no produto acabado não deve
comprometer sua qualidade, segurança e eficácia ( MOSER; MEYER, 2011; DAL
MOLIM GHISLENI et al., 2016).
Os resultados são apresentados na TABELA 15.
TABELA 15 - CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS NAS EMULSÕES
Emulsão
T30 (UFC/g)
T60 (UFC/g)
T90 (UFC/g)
Bactérias
Fungos
Bactérias
Fungos
Bactérias
Fungos
Com conservante
<10
<10
<10
<10
<10
<10
Sem conservante
2,5x104
1,5x104
4,5x105
7,5x105
2,6x106
2,2x106
Com 0,3% F2B1
<10
<10
<10
<10
5,0x103
<10
Com 0,3% F2B3
<10
<10
<10
<10
1,0x103
<10
Com 0,5% F2B1
<10
<10
<10
<10
<10
3,0x105
Com 0,5% F2B3
<10
<10
<10
<10
<10
<10
Com 2% F2B1
<10
<10
<10
<10
<10
<10
Com 2% F2B3
<10
<10
<10
<10
<10
<10
Com 2,5% F2B1
<10
<10
<10
<10
<10
<10
Com 2,5% F2B3
<10
<10
<10
<10
<10
<10
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: T30: tempo de 30 dias; T60: tempo de 60 dias e T90: tempo de 90 dias.
A emulsão sem conservante apresentou uma maior quantidade de micro-
organismos, o que é natural por não apresentar nenhum conservante da formulação,
essas formulações não são estéreis, assim como sua embalagem final e foram abertas
durante o andamento dos ensaios para mimetizar a utilização pelo consumidor. As
formulações com 0,3% de F2B1 e F2B3 apresentaram crescimento bacteriano de
5x103 e 1,0x103, respectivamente após 90 dias de desenvolvimento. A amostra com
0,5% de F2B1 apresentou crescimento para fungos no tempo de 90 dias, esse
crescimento pode não ser devido a concentração do conservante em teste, visto que
na concentração de 0,3% não teve crescimento significativo de fungos. As outras
formulações não apresentaram crescimento mensurável de micro-organismos até 90
dias após o seu desenvolvimento.
4.11 COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS
A análise de compostos fenólicos totais (CFT), corrobora com os achados de
atividade antioxidante das NEs, pois os polifenóis presentes nas amostras podem ser
os responsáveis pela maior atividade antioxidante e atividade antimicrobiana das
amostras (PERUMAL et al., 2021).
99
São produtos vindos do metabolismo vegetal, normalmente derivados de
reações de defesa das plantas. Essa classe apresenta diversas estruturas com pelo
menos um anel aromático com uma hidroxila (OH), sendo classificados de acordo com
sua cadeia carbônica principal. Dentro desses compostos, estão os flavonoides
(flavonas, isoflavonas, flavanóis, flavanonas e antocianidinas), e os compostos não-
flavonoides como os ácidos fenólicos (ácido benzóico, ácido cinâmico) e lignanas
(SINGLA et al., 2019).
Esses compostos apresentam inúmeras atividades biológicas como
antioxidantes, anti-inflamatórias e antimicrobianas, sendo essas as mais evidentes
(LOU et al., 2014; EL-KASHAK et al., 2017). Sua atividade antioxidante se dá pela sua
propriedade de óxido-redução, absorvendo e neutralizando os radicais livres por seus
elétrons presentes em sua estrutura. Atuam estabilizando o radical formado através
da oxidação do fenol (VAN HUNG, 2016).
O reagente do método de Folin-Ciocalteau é a mistura dos ácidos
fosfotúngstico e fosfomolíbdico que apresentam coloração amarelada e reduzem ao
oxidar os compostos fenólicos em pH básico, tornando-se de cor azul (PIRES et al.,
2017).
A curva padrão utilizada para a obtenção dos resultados é mostrada na
FIGURA 28, junto com a equação da reta e o seu coeficiente de determinação (R2).
FIGURA 28 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS
FONTE: A autora (2022).
Os resultados obtidos para os blends são mostrados na tabela 15 e das NEs
são apresentados no GRÁFICO 1.
y = 1,2251x + 0,17
R² = 0,9874
0
0,5
1
1,5
2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
1,2
Concentração (mg EAG/mL)
Absorbância
100
Os blends apresentaram diferença significativa, sendo que o blend 1
apresenta uma maior concentração de compostos fenólicos e apresenta maior
atividade antioxidante demostrada nos ensaios de DPPH e FRAP, o que justifica seu
maior valor de CFT, visto que esses compostos garante uma maior atividade
antioxidante por sequestrarem os radicais livres formados no início do processo de
oxidação (GARCÍA-LAFUENTE et al., 2014; EMBUSCADO, 2015). Entretanto, os
compostos fenólicos apresentam problemas de alta volatilidade, o que ocasiona
restrição do uso de OEs puros, por isso a sua utilização em um sistema
nanoestruturado, como uma NE, é muito mais vantajoso por protegerem esses
compostos bioativos (AZIZKHANI et al., 2021).
Quanto as NEs, deve-se considerar que em suas formulações apresentam
apenas 5% dos blends de OEs, ao calcular 5% dos valores de CFT dos blends, foram
obtidas as faixas de 0,367 - 0,382 e 0,333 – 0,381 mg EAG/mL para blend 1 e 3,
respectivamente. Os resultados obtidos para as NEs em mg EAG/mL foram de: F2B1
(1d): 0,29; F2B1 (90d): 0,33; F2B1a (1d): 0,30; F2B1a (90d): 0,33; F2B3 (1d): 0,27,
F2B3 (90d): 0,32; F2B3a (1d): 0,28 e F2B3a (90d): 0,31, indicando que as NEs após
90 dias para o blend 1 apresentaram valores de CFT mais próximos a 5% dos valores
obtidos para o blend puro e, para o blend 3, a formulação F2B3 (90d) foi a que mostrou
valor mais próximo da faixa determinada. Isso mostra que, apesar de valores
inferiores, a maioria dos CFT permaneceram durante o desenvolvimento das NEs e
essa diferença de valores pode ser resultante da evaporação desses compostos
durante o desenvolvimento das NEs, onde os blends ficam expostos durante agitação
por Ultra-turrax e formação das gotículas, visto que esses compostos apresentam alta
volatilidade (AZIZKHANI et al., 2021). Entretanto, esses valores permaneceram
próximos da proporcionalidade até após 90 dias de desenvolvimento, indicando que
as NEs são eficientes no encapsulamento e proteção contra a evaporação de CFT,
como foi visto no estudo de Faoro (2019), que desenvolveu NE com compostos
fenólicos do bagaço da uva, e obteve teores de CFT nas suas NEs na faixa de 2,60 –
2,90 mg/mL com eficiência de encapsulamento de CFT na faixa de 86% com baixa
redução dos CFT em um período de 30 dias. Ademais, todas as amostras após 90
dias de desenvolvimento apesentaram valores em mg EAG/mL maiores do que as
desenvolvidas após 1 dia, entretanto não houve diferença significativa na quantidade
de compostos fenólicos entre as diferentes formulações do mesmo blend nos mesmos
tempos de análise. As amostras após 1 dia, foram desenvolvidas 24 horas antes das
101
análises com as mesmas matérias-primas das amostras após 90 dias, descartando a
possibilidade de influências edafoclimáticas dos OEs. Como é possível observar nos
ensaios de caracterização das NEs, após um dia e 90 dias as NEs apresentam
diferenças entre tamanho, índice de polidispersão e potencial zeta, essas diferenças
mostram que as NEs necessitam de um período de estabilização inicial, pois os
valores subsequentes aos 7 dias de desenvolvimento apresentam maior proximidade.
Isso foi visto no estudo de estabilidade de NE carregadas com timol de Saatkamp
(2019). Sugere-se que esse tempo prévio de estabilização necessário para as
amostras, pode estar associado com a baixa detecção dos compostos fenólicos 1 dia
após o desenvolvimento da formulação (SAATKAMP, 2019).
102
TABELA 16 - VALORES DE CFT, FT, DPPH, FRAP E ABTS PARA OS BLENDS 1 E 3.
AMOSTRAS
CFT (mg EAG/mL)
FT (mg EC/mL)
DPPH (mmol ET/mL)
FRAP (mmol ET/mL)
ABTS (mmol ET/mL)
Blend 1
7,49 ± 0,15*
1,05 ± 0,06*
9,94 ± 0,81*
6,11 ± 0,83*
18,78 ± 2,88
Blend 3
7,14 ± 0,48
0,78 ± 0,08
5,07 ± 0,62
4,68 ± 0,35
17,60 ± 1,54
p-valor
<0,0401
<0,0336
<0,0194
<0,0001
<0,2674
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: CFT: Compostos fenólicos totais; FT: Conteúdo total de flavonoides; DPPH: Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil; FRAP: Ferric Reducing Antioxidant
Power (poder antioxidante redutor férrico); ABTS: 2,2-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico); EAG: Equivalente
de Ácido Gálico; EC: Equivalente de catequina; ET: Equivalente de Trolox *: Amostras (n=10) com diferença significativa de acordo com teste t (p ≤ 0.05).
GRÁFICO 1 - RESULTADOS DE COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS (CFT) DAS NANOEMULSÕES (NEs)
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: n = 10; CFT: Compostos fenólicos totais; EAG: Equivalente de Ácido Gálico. De acordo
com teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras minúsculas nas colunas azuis indicam diferenças
significativas entre as amostras desenvolvidas com o Blend 1, diferentes letras minúsculas nas
colunas verdes denotam diferenças significativas entre as amostras desenvolvidas com o Blend 3
e diferentes letras maiúsculas indicam diferenças significativas entre todas as amostras.
b CDE
a A
b BCD
a A
b E
a AB
b DE a ABC
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
mg EAG/mL
103
4.12 FLAVONOIDES TOTAIS
Os flavonoides são classificados como uma classe de compostos fenólicos
que apresentam estrutura constituída por três anéis aromáticos sendo dois fenólicos
substituídos e um anel heterocíclico oxigenado, conforme FIGURA 29. A sua
diversidade estrutural faz que sejam subdivididos em classes de acordo com o grau
de insaturação e oxidação do anel heterocíclico (BADSHAH et al., 2020).
FIGURA 29 - ESTRUTURA BÁSICA DOS FLAVONOIDES
FONTE: PATROCÍNIO (2006).
Dentre as atividades biológicas conhecidas desses compostos como anti-
inflamatórios, antialérgicos, antimicrobianos e vasodilatadores, a atividade
antioxidante se destaca por serem compostos doadores de elétrons. Apresentam ação
antioxidante devido a suas estruturas químicas conjugadas e ricas em grupos
hidroxilas (BADSHAH et al., 2020; CIUMARNEAN et al., 2020). Seu efeito antioxidante
pode ocorrer por apenas um dos seus três mecanismos ou por vários ao mesmo
tempo, sendo eles a eliminação das espécies reativas de oxigênio; Impedimento da
produção de espécies reativas de oxigênio através das suas interações com enzimas
que controlam a produção de radicais livres; e, aumento da proteção de sistemas
antioxidantes (CIUMARNEAN et al., 2020).
A curva padrão é mostrada na FIGURA 30, a partir da equação da reta os
resultados foram obtidos.
104
FIGURA 30 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA FLAVONÓIDES TOTAIS
FONTE: A autora (2022).
Os resultados para os blends são mostrados na TABELA 16 e para as NEs no
GRÁFICO 2. O blend 1 apresentou maior quantidade de conteúdo total de flavonoide
(FT) do que o blend 3, 1,05 e 0,78 mg EC/mL, respectivamente. Esse resultado era
esperado, visto que o blend 1 apresentou maior quantidade de compostos fenólicos
totais e também maior potencial antioxidante nas análises de DPPH e FRAP,
considerando que essas moléculas estão relacionadas com a atividade antioxidante
(KHAN et al., 2021).
As faixas teóricas esperadas de FT para as NEs baseado nos 5% do resultado
dos blends é de 0,049 – 0,055 e 0,035 – 0,043 mg EC/mL para blend 1 e 3,
respectivamente.
Assim como para CFT, as NEs desenvolvidas após 1 dia apresentaram valores
mais baixos de FT do que as NEs avaliadas após 90 dias, que apresentaram valores
dentro da faixa esperada. Os resultados foram de 0,04, 0,03, 0,03 e 0,03 mg EC/mL
para F2B1 (1d), F2B1a (1d), F2B3 (1d) e F2B3a (1d), respectivamente, contra valores
de 0,06, 0,05, 0,04, e 0,04 mg EC/mL para F2B1 (90d), F2B1a (90d), F2B3 (90d) e
F2B3a (90d). Entretanto, nesta análise F2B1 (90d) apresentou o maior resultado de
flavonoides, apesar do valor, não é possível afirmar que o tamanho das gotículas
tenha influenciado no resultado, pois F2B3 (90d) e F2B3a (90d) não apresentaram
diferenças significativas em seu conteúdo de flavonoides.
y = 2,0867x - 0,0758
R² = 0,9945
0
0,4
0,8
1,2
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
0,6
Concentração (mg EC/mL)
Absorbância
105
GRÁFICO 2 - RESULTADOS DE FLAVONOIDES TOTAIS (FT) DAS NANOEMULSÕES (NEs)
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: n = 10; FT: Flavonoides totais; EC: Equivalente de catequina. De acordo
com teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras minúsculas nas colunas azuis indicam
diferenças significativas entre as amostras desenvolvidas com o Blend 1, diferentes
letras minúsculas nas colunas verdes denotam diferenças significativas entre as
amostras desenvolvidas com o Blend 3 e diferentes letras maiúsculas entre todas as
amostras indicam diferenças significativas.
4.13 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (AA)
Os resultados significativos de CFT e de FT indicam que os blends e suas
respectivas NEs apresentam potencial atividade antioxidante (AA) devido a presença
dessas moléculas que desempenham essa atividade biológica (MOGHROVYAN et al.,
2019). Entretanto, para determinar esse potencial antioxidante, as análises de DPPH,
FRAP e ABTS foram realizadas, as curvas padrões de cada análise que forneceram
as equações para a obtenção dos resultados são mostradas nas FIGURAS 31, 32 e
33, os resultados para os blends são mostrados na TABELA 16 e para as NEs nos
GRÁFICOS 3, 4 e 5.
O 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2- ácido carboxílico (trolox) utilizado como
padrão é um derivado da vitamina E que apresenta alto potencial antioxidante
(ALONSO et al., 2013).
O radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) apresenta coloração violeta e
quando submetido a uma reação com um doador de átomo de hidrogênio, se torna
amarelado, o DPPH é considerado um modelo de radical lipofílico, sendo amplamente
utilizado para determinar a atividade antioxidante de compostos naturais
(BALASUBRAMANI et al., 2017; SEDAGHAT DOOST et al., 2019).
b; B
c; E
b; BC
a; A
b; BC a; BC
b; D
a; CD
0,00
0,04
0,08
mg EC/mL
106
O ensaio de redução do ferro (FRAP – Ferric Reducing Antioxidant Power
Assay) consiste na habilidade da amostra em reduzir o Fe3+ em Fe2+, em pH ácido. O
complexo Fe3+-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) apresenta coloração azul clara, quando
a amostra com atividade antioxidante atua junto com o TPTZ, o complexo Fe2+ - TPTZ
é formado e este apresenta coloração azul intensa, indicando atividade de redução do
ferro pela amostra (PIRES, 2014; AZIZKHANI et al., 2021).
O radical catiônico ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfônico (ABTS),
é formado a partir de reações enzimáticas ou químicas, como com o persulfato de
potássio. Apresenta cor esverdeada que é perdida a medida que é neutralizado por
uma substância antioxidante. É solúvel em água e em solventes orgânicos, permitindo
análises de amostras com diferentes polaridades (MATSUMOTO et al., 2022).
FIGURA 31 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA DPPH
FONTE: A autora (2022).
FIGURA 32 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA FRAP
FONTE: A autora (2022).
y = -1,9747x + 2,0546
R² = 0,9857
0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
1,2
Concentração (mg ET/mL)
Absorbância
y = 0,7778x - 0,0536
R² = 0,9856
0
0,6
1,2
1,8
0 0,5 1 1,5 2
2,5
Concentração (mg ET/mL)
Absorbância
107
FIGURA 33 - CURVA PADRÃO OBTIDA PARA ABTS
FONTE: A autora (2022).
O blend 1 apresentou maior capacidade em neutralizar o radical DPPH, do
que o blend 3, com valores de 9,94 e 5,07 mmol ET/mL, respectivamente, e em
redução do ferro, 6,11 e 4,68 mmol mmol ET/mL. A atividade de neutralização para o
radical ABTS também foi superior, entretanto não apresentou diferença significativa
ao blend 3 que apresentou valor de 17,60 aos 18,78 mmol ET/mL do blend 1.
No estudo de Fedérle (2018), o B3 apresentou maior potencial atividade
antioxidante para DPPH (AA(%)), com valores de 83,18 (0,80μL/mL); 72,98
(0,40μL/mL), 55,77 (0,20μL/mL) e 34,80 (0,10μL/mL). Para o B1 80,58 (0,80μL/mL),
67,65 (0,40μL/mL), 50,03 (0,20μL/mL) e 30,49 (0,10μL/mL), os valores apresentam
proximidade, entretanto apresentam diferenças significativas, contudo sugere-se que
essa variação esteja relacionada a diferenças edafoclimáticas, pois variações de
temperatura e localização geográfica influenciam na produção dos metabólitos
secundários como é o caso dos OEs, ainda mais que ambos os blends apresentam
pequena variação em sua composição (CARALT et al., 2013; SHAH et al., 2014).
Considerando que as NEs apresentam 5% dos blends e os resultados de
potencial AA obtidos para os blends, as NEs devem apresentar resultados teóricos
para blend 1 e blend 3, respectivamente, na faixa de 0,46 – 0,54 e 0,22 - 0,28 mmol
ET/mL para DPPH; 0,26 – 0,35 e 0,22 – 0,25 mmol ET/mL para FRAP e 0,79 – 1,08
e 0,80 – 0,96 mmol ET/mL para ABTS.
Com exceção das formulações desenvolvidas com agulha na análise de
ABTS, as NEs desenvolvida após 1 dia continuam apresentando resultados inferiores
aos obtidos após 90 dias como ocorrido nas análises anteriores, reforçando o dado
de necessidade de estabilização desses sistemas.
y = -1,1811x + 2,4732
R² = 0,9929
0
0,6
1,2
1,8
0 0,6 1,2 1,8
2,4
Concentração (mg ET/mL)
Absorbância
108
A AA para DPPH foi de 0,25, 0,55, 0,26, e 0,37, mmol ET/mL para F2B1 (1d),
F2B1 (90d), F2B1a (1d), F2B1a (90d), e de 0,23, 0,32, 0,21, 0,29 mmol ET/m para
F2B3 (1d), F2B3 (90d), F2B3a (1d) e F2B3a (90d), respectivamente. Apenas F2B1
(90d) apresentou valor superior e dentro da faixa para blend 1 e F2B3 (1d e 90d) e
F2B3a (90d) apresentaram valores superiores e dentro da faixa estabelecida e para
blend 3.
A AA observada através do método de FRAP foi de 0,24, 0,28, 0,28 e 0,41
mmol ET/mL, para F2B1 (1d), F2B1 (90d), F2B1a (1d), F2B1a (90d) e de 0,17, 0,36,
0,21 e 0,25 mmol ET/mL, para F2B3 (1d), F2B3 (90d), F2B3a (1d) e F2B3a (90d),
respectivamente. Apenas a formulação F2B1 (1d) não apresentou valor dentro da
faixa calculada de 5% do blend 1 para análise de FRAP e as amostras com blend 3
avaliadas após 1 dia também não estão dentro da faixa calculada.
O método de captura do cátion ABTS apresentou resultados de 0,87, 0,97,
0,94 e 1,01 mmol ET/mL para F2B1 (1d), F2B1 (90d), F2B1a (1d), F2B1a (90d) e de
0,89, 1,05, 0,83 e 1,04 mmol ET/mL, para F2B3 (1d), F2B3 (90d), F2B3a (1d) e F2B3a
(90d), nesta análise todas as amostras apresentaram resultados dentro das faixas de
5% calculadas para cada blend, com destaque para F2B3 (90d) e F2B3a (90d) que
apresentaram resultados superiores ao calculado para o blend 3.
Nas NEs foi possível verificar uma potencial AA presente, quando
comparadas aos blends puros, em algumas análises foram obtidos valores até
superiores do que a faixa calculada o que é encontrado para estudos que realizam
métodos de avaliação da AA entre o OE puro e sua respectiva NE, como no estudo
de Doost e colaboradores (2019) onde NEs de timol apresentaram valores de AA pela
metodologia de DPPH superiores do que quando comparados aos valores obtidos do
timol livre, devido as seguintes hipóteses: Quando encapsulado as moléculas de
hidrogênio (H) ficam mais expostas devido ao menor tamanho de gotícula, facilitando
a transferência para a substância oxidante (DPPH) ou devido a presença de água no
meio que pode acelerar a transferência dos átomos de H, aumentando a capacidade
de redução do DPPH, para o ensaio de FRAP as NEs também apresentaram
resultados superiores; No estudo de Balasubramani e colaboradores (2018), suas NEs
de OE de manjericão também apresentaram valores de AA superiores do que o OE
livre nos ensaios de DPPH, entretanto no ensaio de FRAP o OE apresentou maior
capacidade antioxidante; Azizkhani e colaboradores (2020) encontraram valores
superiores, entretanto sem diferença significativa para NEs do OE de estragão pelo
109
método de FRAP e na AA por DPPH, a NE apresentou valores superiores do que o
OE de estragão puro; No estudo de Rinaldi e colaboradores (2017) as NEs do OE de
sementes de nim apresentaram AA superior ao OE puro para análise de ABTS, DPPH
e FRAP.
Assim como nas análises de CFT e FT as NEs obtidas após 1 dia foram as
que apresentaram valores fora da faixa calculada, indicando que para a realização
das análises de AA também é necessário respeitar o tempo de estabilização do
sistema (SAATKAMP, 2019). Para as NEs a diferença significativa de AA entre os
dois blends é vista na análise de DPPH e FRAP, considerando análises após 90 dias
entre as NEs, e é justificada devido a sua diferença de composição entre OE de menta
e OE de orégano. As amostras que não apresentaram valores de AA superior a faixa
calculada podem estar relacionadas com a perda de compostos por evaporação,
devido a alta volatilidade dos compostos fenólicos durante o desenvolvimento das
NEs, que estão mais relacionados com a AA (AZIZKHANI et al., 2021), ou em virtude
da alteração do coeficiente de partição para a formação das gotículas e estabilização
com os surfactantes, o que torna os OEs mais hidrofílicos, fazendo com que suas
atividades biológicas sejam alteradas (MEDEIROS, 2014), ou ao seu efeito sinérgico
de atuação, que pode estar diminuído devido a fragmentação em gotículas, ou ainda
em função do efeito das outras matérias-primas presentes na composição das NEs
(AGOSTINHO, 2017).
Todavia, apesar das diferenças de valores e da não diferença significativa
para o método de ABTS, a capacidade antioxidante é revelada por esses métodos,
mesmo que apresentem diferenças de valores entre um método e outro devido as
condições específicas das reações ocorridas em cada metodologia, eles mostram
potencial AA por diferentes mecanismos (DESTRO, 2019).
110
GRÁFICO 3 - RESULTADOS DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE A PARA DPPH DAS NEs
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: n = 10; AA: Atividade antioxidante; ET Equivalente de Trolox. De acordo com
teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras minúsculas nas colunas azuis indicam
diferenças significativas entre as amostras desenvolvidas com o Blend 1, diferentes letras
minúsculas nas colunas verdes denotam diferenças significativas entre as amostras
desenvolvidas com o Blend 3 e diferentes letras maiúsculas entre todas as amostras
indicam diferenças significativas.
GRÁFICO 4- RESULTADOS DE FRAP DAS NEs
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: n = 10; AA: Atividade antioxidante; ET Equivalente de Trolox. De
acordo com teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras minúsculas nas
colunas azuis indicam diferenças significativas entre as amostras
desenvolvidas com o Blend 1, diferentes letras minúsculas nas colunas
verdes denotam diferenças significativas entre as amostras desenvolvidas
com o Blend 3 e diferentes letras maiúsculas entre todas as amostras indicam
diferenças significativas.
b; CD
c; A
b; BCD
a; A
b; CD
a; B
c; D
a; BC
0,00
0,20
0,40
0,60
mmol ET/mL
b; BC
c; D b; DB
a; A
b; CD
c; D
b; CD
a; B
0,00
0,15
0,30
0,45
mmol T eq./mL
111
GRÁFICO 5 - RESULTADOS DE POTENCIAL AA PARA ABTS DAS NEs
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA n = 10; AA: Atividade antioxidante; ET Equivalente de Trolox. De acordo com
teste de Duncan (p ≤ 0.05), diferentes letras minúsculas nas colunas azuis indicam
diferenças significativas entre as amostras desenvolvidas com o Blend 1, diferentes letras
minúsculas nas colunas verdes denotam diferenças significativas entre as amostras
desenvolvidas com o Blend 3 e diferentes letras maiúsculas entre todas as amostras
indicam diferenças significativas.
4.14 CITOTOXICIDADE
O ensaio de redução do sal de MTT avalia a viabilidade celular através da
capacidade metabólica das células e fornece um conhecimento prévio sobre a
segurança das formulações quando entram em contato com as células dos seres vivos
(DE GODOI et al., 2017). É um método colorimétrico, o sal de tetrazólio é reduzido
pelas células viáveis a formazan, um precipitado de coloração roxa que quando
solubilizado forma uma solução uniforme de absorbância mensurada. A cor roxa é
proporcional ao número de células viáveis (RISS, et al., 2011).
As concentrações das NEs e dos blends utilizados para a realização deste
ensaio, foram determinadas levando-se em consideração dois parâmetros: As
concentrações que inibiram o crescimento microbiano e a quantidade de OE presente
nas formulações.
Os resultados do blend 1 e suas respectivas NEs são mostrados no GRÁFICO
6 e os resultados do blend 3 e suas respectivas NEs no GRÁFICO 7.
b; ABC
a; AB ab; AB
a; AB
b; C
a; A
ab; BC
ab; AB
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
mmol ET/mL
112
GRÁFICO 6 - VIABILIDADE CELULAR FRENTE AO BLEND 1, F2B1 E F2B1a
12,5
5,0
7,5
10
0
25
50
75
100
125
150 CTRL
blend1
Blend 1
CTRL
veíc u lo
F2B1
F2B1a
D
a
D
a
E
c
J
c
E
c
J
c
E
b
J
b
E
c
J
c
E
c
J
c
(Pg/mL)
Viabilidade celular
(% em relação ao controle)
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: Viabilidade celular determinada após o tratamento de células McCoy com blend
1, F2B1 e F2B1a pelo período de 72 h. α, β e γ representam diferença estatisticamente
significativa em relação ao controle blend 1, F2B1 e F2B1a, respectivamente. a, b, e c
representam diferença estatisticamente significativa de p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001,
respectivamente.
GRÁFICO 7 - VIABILIDADE CELULAR FRENTE AO BLEND 3, F2B3 E F2B3a
12,5
5,0
7,5
10
0
25
50
75
100
125
150
CTRLblend3
Blend 3
CTRLveíc ulo
F2B3
F2B3a
Ea
Ja
Eb
Jc
Eb
Jc
Ec
Jc
Ec
Jb
(
P
g/mL)
Viabilidade celular
(% em relação ao controle)
FONTE: A autora (2022).
LEGENDA: Viabilidade celular determinada após o tratamento de células McCoy com blend 3,
F2B3 e F2B3a pelo período de 72 h. β e γ representam diferença estatisticamente significativa
em relação a F2B3 e F2B3a, respectivamente. a, b, e c representam diferença estatisticamente
significativa de p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente.
Os GRÁFICOS 6 e 7 mostram que todas as amostras avaliadas apresentaram
viabilidade celular > 60%, portanto nenhuma das NEs apresentou citotoxicidade
significativa. Esses resultados sugerem, de forma preliminar, que todas as NEs
avaliadas são seguras para a sua utilização na faixa de concentração de OE de (1 a
10 μg/mL), equivalente as porcentagens de 0,002 – 0,02% das NEs. Entretanto, como
é possível observar no gráfico 6, o blend 1 apresentou uma menor viabilidade celular
quando comparado ao seu controle nas concentrações de 7,5 e 10 μg/mL. Ainda, o
113
blend 1 induziu maior citotoxicidade quando comparado com as NEs. Sugere-se que
os resultados obtidos podem ser justificados pelo fato de que, os OEs puros por
apresentarem um caráter altamente hidrofóbico, são capazes de interagir e atravessar
a membrana plasmática, promovendo maior citotoxicidade (CHOUHAN; SHARMA;
GULERIA, 2017; CARBONE et al., 2018).
Como visto no GRÁFICO 7, o blend 3 também apresenta maior potencial
citotóxico quando comparado com as NEs, entretanto não apresenta diferença
significativa, quando comparado ao controle. Salienta-se que os dados obtidos
corroboram a literatura, em estudo realizado por Maccelli e colaboradores (2020), as
NEs desenvolvidas com o OE de Satureja montana L. foram menos citotóxicas do que
o OE puro em linhagem celular de câncer de bexiga humana (T24).
A citotoxicidade do veículo das NEs, formulação com água, tween 80 e span
80 nas proporções utilizadas, onde a fase oleosa foi substituída por água, foi avaliada
e comparada com o controle normal (100% de viabilidade celular) e não foi observada
citotoxicidade (dados não mostrados).
Quando observamos os resultados das NEs comparadas com o seu controle
que não apresenta os blends, não foi vista citotoxicidade nem redução da viabilidade
celular. Sugere-se que este fato seja decorrente do sistema nanoestruturado presente,
que diminui a hidrofobicidade dos OEs, uma vez que os excipientes da formulação
diminuem o coeficiente de partição dos blends, alterando a sua interação e penetração
através da membrana plasmática, minimizando os possíveis efeitos citotóxicos dos
OEs (MEDEIROS, 2014).
Novamente, os dados obtidos corroboram a literatura. No estudo de De Godoi
e colaboradores (2017), as NEs de OE de Eucalyptus globulus em concentrações de
0,1%, não causaram citotoxicidade em células mononucleares do sangue periférico,
bem como evitaram a morte celular induzida pela aplicação do OE puro.
As NEs apresentaram porcentagens de viabilidade celular, com valores acima
de 100% (GRÁFICOS 6 e 7). Esses resultados sugerem que as NEs exerceram um
estímulo sobre a proliferação celular, porém mais estudos são necessários para
comprovar a indução deste efeito. Salienta-se, entretanto que o possível estímulo da
proliferação de fibroblastos exercido pelas NEs, tornaria estes ativos ainda mais
interessantes, visto que fibroblastos são células precursoras de colágeno em
humanos (SOUZA; CASTRO; SILVA, 2021).
114
5 CONCLUSÃO
Nanoemulsões (NEs) de blends de óleos essenciais (OEs) foram
desenvolvidas por um método de alta agitação por Ultra-Turrax com os tensoativos
Tween 80 e Span 80, comprovando que a combinação de tensoativos de equilíbrio
hidrófilo-lipófilo (EHL) diferentes garantem maior estabilidade. Elas foram produzidas
de duas formas que conferiram diferentes tamanhos de gotícula, entre 100 até 286
nm, com distribuição homogênea (IPD 0,190 – 0,460), potencial zeta em torno de -23
à -35 mV, com morfologia, em geral, lisa e esférica, densidades próximas de 1,00
g/mL e valores de pH condizente com os de conservantes para produtos cosméticos
já presentes no mercado.
As formulações das NEs apresentaram estabilidade até 90 dias após seu
desenvolvimento, período em que foram caracterizadas, e até a finalização desde
trabalho não apresentaram alterações organolépticas e visuais. Entretanto, as
amostras necessitam de um tempo de estabilização maior do que 1 dia para a
realização de testes de caracterização e análises de suas propriedades.
As NEs foram efetivas como antimicrobianos para os micro-organismos
testados após 30 e 90 dias de desenvolvimento e as de menores tamanhos
apresentaram maior potencial. No challenge test, atuaram como bons conservantes
da formulação na concentração testada, sendo desafiadas duas vezes durante o
ensaio, reforçando a sua possível aplicação.
Emulsões foram avaliadas por 90 dias em temperatura ambiente quanto aos
seus parâmetros organolépticos, pH e contagem de micro-organismos, todos
apresentaram resultados promissores nas concentrações de NEs avaliadas.
As amostras ainda apresentam compostos fenólicos e flavonoides, que estão
diretamente relacionados com a sua atividade antioxidante (AA), que foi mantida e em
alguns casos até superior quando comparadas aos blends puros. Não foi identificado
citotoxicidade nas concentrações e linhagem celular avaliada, mostraram viabilidade
celular superior aos blends, inclusive com valores indicativos de possível atividade
proliferativa. Entretanto para essa atribuição biológica seriam necessários estudos
mais específicos.
Segundo os parâmetros avaliados, as NEs desenvolvidas apresentam grande
potencial de utilização como conservantes naturais de emulsões cosméticas, com
115
potencial atividade antioxidante, sem citotoxicidade e ainda conferem uma fragrância
agradável ao produto.
116
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